RNase R

アプリケーション

• 選択的スプライシングおよび遺伝子発現研究
• イントロンcDNAの調製
• cDNAライブラリーのイントロンスクリーニング

大腸菌由来Ribonuclease R(RNase R)はほぼ全ての直鎖状RNAを分解するマグネシウム依存性の3’→5’エキソリボヌクレアーゼですが、投げ縄（ラリアット）構造または環状のRNA1,2や7ヌクレオチド未満の3’突出部を持つ二本鎖RNAは分解しません2。RNase Rは、tRNA、5S RNAおよびイントロンの投げ縄構造を除き、ほとんどのcellular RNAを分解します（図1）。投げ縄構造の3’末端は、RNase Rによって2’,5’-ホスホジエステル結合のある分枝部位まで切り取られます。mRNA前駆体からイントロン領域がスプライシングされる際に生じる投げ縄構造は、total RNAの混合物中からRNase Rを用いて抽出することができます。このようなtotal RNAの調製にはArrayPure™ Kit、MasterPure™ RNA Purification KitおよびMasterPure™ Yeast RNA Purification Kitが理想的です。
この方法で抽出されたRNAは、イントロンと予測される配列を含むマイクロアレイまたは完全長の染色体やゲノムのオーバーラップ領域を含むタイルアレイをターゲットとする標識化cDNAを調製するためのテンプレートに利用できます。イントロンが直鎖状になったcDNAが得られるのではなく、イントロンに由来する配列を含むcDNAが得られます。

ユニットの定義

標準的な条件下、37℃で10分間に1 μgのpoly(A)を酸可溶性ヌクレオチドに変換するRNase R活性を1単位とする。

保存バッファー

50 mM Tris-HCl (pH7.5)、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.1% Triton^® X-100を含む50%グリセロール溶液

RNase R 10X 反応バッファー

0.2 M Tris-HCl (pH8.0)、1 M KCl、1 mM MgCl₂

注： RNase R活性には低濃度(0.1~1.0 mM)のマグネシウムが必要です。基質RNA溶液中に低濃度のEDTAが含まれるとRNase R活性は低下します。MgCl₂を終濃度1 mMまで添加することにより、基質溶液中に含まれるEDTAの影響を打ち消すことができます。RNase R活性の至適温度は37℃です。

品質管理

RNase Rは、直鎖状および環状RNAオリゴヌクレオチドの混合物を含む反応液を用いて機能試験が行われており、直鎖RNAのみを分解することが確認されています。

至適温度/温度不活性

至適温度：37℃
温度不活性：not determined

参考文献

1. Suzuki, H. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34, 63.
2. Vincent, H.A. and Deutscher, M. P. (2006) J. Biol. Chem. 281, 29769.

図１　RNase Rによるイントロンの投げ縄(ラリアット)構造のプロセシングの概要

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