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RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5x Master Mix

ウイルスおよび病原体を1ステップで検出
大規模PCR検査およびポイントオブケア検査(POC)のワークフローを簡便に

RapiDxFire™ Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixは、細菌性およびウイルス性病原体の高感度かつ再現性のある検出が行えるシングルチューブの便利なマスターミックスです。
遺伝子特異的プライマーおよびBHQプローブを用いたマルチプレックスに最適化されおり、高い温度安定性・グリセロールフリーのため、ハイスループットや自動化されたシステムでのテストやPOCデバイスで凍結乾燥品を利用したテストを開発する分子診断キットメーカーにとって理想的な製品です。
5xマスターミックスには、熱活性化熱安定性逆転写酵素、Taq DNA ポリメラーゼ、および dNTP (dUTP を含む) が含まれており、Tritonフリー、グリセロールフリーの単一バッファー溶液になっています。RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mix は、キャリーオーバーコンタミネーションを制御するために追加されたウラシル N-グリコルシラーゼ (UNG) やテンプレート保存のためのRNase 阻害剤と互換性があり、診断テスト開発のための汎用コンポーネントです。

特長

  • 高感度:シングル及びマルチプレックス反応における低コピーRNA及びDNAターゲットを検出
  • シングルチューブ、室温で安定した構成により、自動化ワークフローを合理化
  • グリセロールフリーのため凍結乾燥オプションが利用できます。
  • 5倍濃縮のマスターミックスにより、反応溶液へのサンプル添加量の増加、または凍結乾燥ビーズ量の低減が可能
  • ISO 13485認証施設にて製造

RNAターゲットとDNAターゲットの高感度検出

Figure 1. RNA及びDNAターゲットへの幅広いダイナミックレンジ

(a)SARS-CoV-2 RNA control (Twist) を10倍段階希釈し、1反応あたり1 x106-1x100コピーを使用し、UltraDx SARS-CoV-2 N1/N2/RnP アッセイ (Biosearch Technologies) を実行しました(N1/N2:FAM のデータを示しています (総反応液量:20 µL)。(b) マウスのゲノム DNAを10倍段階希釈し、一反応あたり300,000 から3コピーを使用し、Isg20 アッセイを行いました(FAMのデータを示しています) (総反応液量:20 µL)。
(a) SARS-CoV-2 RNA および (b) マウスのゲノムDNAアッセイのPCR効率90-110%、R2値>0.98であり、PCR基準を満たしました。

反応液の室温安定性の拡張

Figure 2.室温で完全に組み立てられた反応混合液は最大8時間、全てのターゲットに対して安定した感度の高いCq値を示します

ゲノムMS2 RNA (1反応あたり100コピー, 総反応液量:20 µL) をトリプレックスで、MS2-領域特異的BHQプロ―ブに固有の蛍光を割り当て、テストを実施しました。((a) R6D1:FAM; (b) R3D3:CAL Fluor Orange 560 (c) ) R8D1:クエーサー 705)
RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mix 、競合他社A、競合他社B、をメーカーの推奨に従い、テストしました。Cq 値が低いほど、検出の感度が高くなります。Cq 値≥50は増幅がないことを示します。

凍結乾燥互換性

Figure 3. 凍結乾燥後の RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixの一貫した性能 (4 mM MgCl2 を添加)

凍結乾燥されたビーズは、反応ごとに 1x107 - 1x102コピーから10倍連続希釈されたゲノムMS2 RNAに対してテストされ (20 µLの総反応容量)、各MS2領域特異的BHQプローブには固有の蛍光体 (R6D1:FAM; R3D3:CAL Fluor Orange 560; R8D1: Quasar705)が割り当てられました。(a) 凍結乾燥前および (b) 凍結乾燥後の増幅曲でR6D1:FAMアッセイにてテストされました。すべてのターゲットの標準曲線、PCR 効率 (90%-110%) および R2 値 >0.98でPCR基準を満たします。

凍結乾燥ビーズでの長期安定性

Figure 4. 室温 (25℃) で 0~4ヶ月の保存後に示された凍結乾燥ビーズの安定性

凍結乾燥ビーズ(Lyobeads)はRapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixを使用して調製し、反応ごとに1x107 - 1x102 コピーから10 倍連続希釈したゲノム MS2 RNAに対してテストしました(20 µL総反応量)。各MS2領域固有のBHQ プローブには、固有の蛍光体(R6D1:FAM; R3D3:CAL Fluor Orange 560; R8D1:Quasar 705) が割り当てられました。 (a)保管期間0ヶ月および (b)保存期間4ヶ月時点の増幅曲線でR6D1:FAM アッセイおよび全てのターゲットの標準曲線でテストされました。PCR 効率 (90%-110%) および R2 値 >0.98、PCR 基準を満たしています。

上記結果は、サンプル中のアッセイとテンプレートの種類/濃度、およびマスターミックス自体の特性によるものです。そのため個々の結果は異なる場合があります。

商品名 Cat.No. 容量 反応数
RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mix 30060-1 1mL 250
30060-2 10mL 2,500
30060-3 100mL 25,000

内容:5x Master Mix (Glycerol-free, Triton X-100 free buffer)

FAQ

Q1. 必要な最小RNA濃度/純度はどれくらいですか?
最小RNA濃度はアッセイに依存します。適切に設計されたオリゴと精製されたRNAを使用すると、RNAターゲットを1反応あたり5〜10コピーで検出できます。適切な核酸の純度と測定の詳細については、MIQEガイドライン(RapiDxFire™Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mix manualのセクション12.3を参照)を参照してください。
Q2. 臨床サンプルから分離されたRNAにおける1-step RT-qPCRを行うための特別な推奨はありますか?
核酸(DNAまたはRNA)は、サンプル/輸送培地に特異的な阻害剤およびRNA分解酵素のために、臨床サンプルからは精製する必要がある可能性があります。たとえば、RNA精製には最適な精製のためにsbeadex Pathogen Nucleic Acid Purification Kit(型番NAP40-025-01など)をお勧めします。
Q3. 反応液にRNaseインヒビター(阻害剤)を加える必要がありますか?
RNase阻害剤を含めるかどうかは、サンプルの種類によって異なります。 適切に処理された精製RNAの場合には、RNase阻害剤の添加を必要としません。
必要に応じて、RiboGuard RNase Inhibitor(型番RG90925)をRapiDxFireLyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixに添加して、最終濃度を1U/µLにすることができます(例:40U/µL RiboGuard RNase Inhibitor 0.5 µLを20 µL反応液になるように添加)
Q4. 熱活性化逆転写酵素の活性化時間を短縮できますか?
熱活性化時間の短縮はお勧めしません。逆転写酵素を完全に活性化するには、3分の活性化時間をお勧めします。ただし、アッセイの最適化により、他の温度サイクルパラメータ、サンプルの種類、感度要件などの他の要因に応じて、活性化時間を最低1分に短縮できる場合があります。
Q5. 熱安定性Taqポリメラーゼの活性化時間を短縮できますか?
はい。
Q6. RapiDxFire Lyo-Flex1-Step RT-qPCR 5X Master Mixを使用して、シングルプレックスアッセイとマルチプレックスアッセイの両方を実行できますか?
はい。
Q7. RapiDxFire Lyo-Flex1-Step RT-qPCRシステムのプライマーを設計する際に考慮すべきことはありますか。
逆転写酵素の最適な反応温度は60-70℃です。設計されるプライマーは、使用される逆転写反応温度(60℃を推奨)に適した融解温度(TM)を持つことが重要です。
Q8. マルチプレックスRT-qPCR反応を開発する際に特別な考慮事項(プライマーとプローブの濃度など)はありますか。
標準のqPCRプライマー設計の考慮事項を適用する必要があります。これらには、アッセイ内およびアッセイ間のプライマーとプローブ間の融解温度(TM)の類似性、およびアッセイ間のプライマーダイマー/交差反応性の回避が含まれます。プライマーとプローブの設計に関する考慮事項の詳細については、MIQEガイドライン(RapiDxFire™Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixマニュアルのセクション12.3を参照)を参照してください。
Q9. cDNA合成ステップを実行できる最高温度はどれくらいですか?
cDNA合成の最高温度は、使用するプライマーの融解温度(TM)に部分的に依存します。他の要因には、目的のアンプリコンの長さ、および潜在的なRNA二次構造があるかどうかが含まれます。
Q10. サーマルサイクラーにROX™が必要な場合はどうすればよいですか? どの装置が利用できますか?
パッシブリファレンス色素を使用するには、機器で推奨される濃度のROXを補充します。RapiDxFireLyo-Flex1-Step RT-qPCR 5X Master Mixは、Applied Biosystems ABI 7500、Thermo Fisher QuantStudio7、およびBIO-RADCFX96でテストされています。
Q11. ウラシル-DNAグリコシラーゼ(UDG)を追加できますか? ミックスにはdUTPが含まれていますか?
RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master MixにはdUTPが含まれているため、UDGを反応液に追加が行えます。
Q12. 室温でRT-qPCR反応をセットアップできますか?
はい。
Q13. 5X Master Mixは室温、または4℃でどれくらい安定していますか?
RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixは、4℃で最大4週間、25℃で最大7日間、40℃で6-24時間安定であることが示されています。 RapiDxFire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixを40℃以上の温度で保存することは推奨しません。
Q14. sbeadex Pathogen Nucleic Acid Purification Kitはこのマスターミックスと互換性がありますか?
はい。
Q15. RapiDx Fire Lyo-Flex 1-Step RT-qPCR 5X Master Mixを凍結融解は何回できますか?
繰り返しの凍結融解(<10回)は避けてください。

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