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RapiDxFire Thermostable Reverse Transcriptase

60℃以上の高温でも反応可能な温度耐性逆転写酵素

特長

  • 高温(55-80℃)で活性を保持:多様なRNAテンプレートからのcDNA合成の特異性を向上
  • 高感度:2段階RT-qPCRアッセイで100コピーのRNAを検出
  • 短い反応時間 (5 分以内): 合理化された RT-qPCR ワークフローと結果までの時間の短縮
  • 室温で安定 (>3ヶ月): 自動化デッキでのセットアップを簡素化し (冷蔵保管が不要)、冷蔵保管が制限された環境での使用を可能にします。
  • 凍結乾燥可能: 凍結乾燥を妨害するグリセロールやその他の成分を含みません。
  • 高いバッチ間再現性:ISO13485認証取得工場で製造

RapiDxFire Thermostable Reverse Transcriptase は、一般的な MMLV および AMV 逆転写酵素よりも大幅に進歩しています。温泉で発見されたこの強力なバクテリオファージ由来酵素は、高温で非常に高い活性を示し (90℃、10分後に約 60%の活性が維持されます)、20-25℃で3ヶ月以上保存した後もコアとなる活性を維持しています。この酵素は、RNAse H および 3'→5' エキソヌクレアーゼ活性を欠いており、短いcDNAフラグメント(≤ 1 Kb) を効率的に合成します。他の逆転写酵素と同様に、RapiDxFire RTは、DNA ポリメラーゼ活性を持っていますが、5'→3' エキソヌクレアーゼ活性を欠いています。保存バッファーにはグリセロールおよびTriton™ X-100を含まないため、酵素を凍結乾燥することができます。

高い温度でベストのパフォーマンス

Figure 1. 耐熱性逆転写酵素の反応温度プロファイル

各メーカーが推奨するバッファーを使用して試験した条件ごとに、氷上で3回分の反応をセットアップし、指定された温度に移し、40分間インキュベートしました。次に、Tecan Infinite M1000 Pro マイクロプレート リーダーで PicoGreen 蛍光アッセイを利用して、RNA/cDNA・RNA-DNAヘテロ二本鎖を検出しました。 RapiDxFire Thermostable RT は、反応温度が 80℃まで上昇するにつれて活性が増加します (テストした最高温度)。90℃で10分後でも~ 60%の活性が残っています (data not shown)。

ジカウイルスの高感度検出

Figure 2.異なる熱安定性逆転写酵素を使用した 2 ステップ RT-qPCR 反応におけるcDNA合成時間経過

A) 1分間の逆転写反応後のqPCR曲線。ジカウイルスcDNA合成は、ターゲット特異的プライマー、推奨される反応バッファーおよびサプライヤーのガイドライン(RapiDxFire = 60℃、サプライヤー B=50℃、およびサプライヤーT= 55℃) のインキュベーション温度を使用して、各酵素に対して 2 回ずつ実施されました。cDNA合成後、各cDNAサンプルの1/10量を用いてリアルタイムPCRを行った。PCRはEconoTaqと付属のバッファー(品番30031-3)を用いて行いました。PCR産物の検出は、インターカレート色素 (Dyomics Cat No. V13-01184)とBioRad CFX C1000 Touch™ (吸収/発光 481nm/526nm) を使用してリアルタイムで行われました。 B) 2 番目のステップのリアルタイム PCR を実行する前の逆転写時間経過研究。 丸で囲まれたデータ ポイントは、A) の qPCR 曲線で表されるデータに由来します。

3ヶ月の室温安定性

Figure 3. 熱安定性RapiDxFire逆転写酵素は、室温および-20℃で各時点に分割して保存されました。各時点で、10,000コピーのMS2 RNAのファーストストランドcDNA合成を測定することにより、RapiDxFire Thermostable RTを評価しました。MS2の遺伝子特異的プライマーを用いて、反応温度60℃で5分間、cDNA合成を行いました。cDNAは、リアルタイムPCRおよび520bpアンプリコン周辺のMS2プライマー設計を使用して測定しました。

製品仕様

  • 保存温度:-20℃
  • 保存バッファー:グリセロールフリー、Triton X-100フリーで提供
  • ユニット定義: 1 RT単位は、55℃で10分間に1 nmolのdTTPを酸不溶性形態に組み込むのに必要な酵素の量として定義されます (テンプレートプライマーとして poly(rA) oligo(dT) およびキット付属の緩衝液1X bufferを使用)。
  • 機能QCアッセイ: RapiDxFire Thermostable RTは、プライマーとバクテリオファージMS2 RNAを使用して機能的にテストされています。この反応では、酵素は60℃で5分間で、1,000コピーのMS2 RNAを520 bpのcDNAに変換します。
  • エンドヌクレアーゼ: 10単位レベルでエンドヌクレアーゼの混入はありません。
  • エキソヌクレアーゼ: 10単位レベルでエキソヌクレアーゼの混入はありません。
  • RNase活性: 蛍光ベースのRNase活性アッセイを使用して検出されたRNase活性はありません。
製品名 型番 容量
RapiDxFire Thermostable 30250-1 50反応
Reverse Transcriptase 30250-2 250反応

内容:RapiDxFire Thermostable RT, 10X Thermostable RT Buffer

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