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White Paper: Rapid detection of gene-editing events and genotyping using DNA isolated with QuickExtract™ DNA Extraction Solution

遺伝子編集技術は、それらの治療上の可能性および疾患モデリング、創薬、およびアグリゲノミクスなどの多様な研究分野におおいて、近年かなりの注目を集めています。すべての遺伝子編集方法に共通の基本的な要件は結果の検証です。QuickExtract™DNA Extraction Solutionは、その迅速さ、便利さ、および自動化の容易さから、PCRベースでの検証のためにゲノムDNAを抽出するための試薬として使用されていrます。また、PCRベースのジェノタイピングでも幅広いサンプルタイプで使用されています。

イントロダクション:

ダウンストリームアプリケーション用に核酸を単離する場合、研究者は一般的に2種類の方法から選択します。精製は高品質のDNAまたはRNAを提供する多段階のより長い手順であり、抽出はその後のPCR、RT-PCR用の迅速な手順です。QuickExtractファミリー製品は、さまざまなサンプルからPCR-ready DNAを抽出するための簡単で迅速な方法を提供します。ほとんどのサンプルにおいて、手順はわずか8分で完了します。 QuickExtract製品は、スピンカラムの使用を必要としないシングルチューブプロトコールで使いやすく、サンプルロスがかなりあります。

QuickExtractワークフローは有毒化学物質の使用を避け、ロボット自動化システムを備えたマルチウェルプレートに容易に適応します。QuickExtrac手法は抽出速度が速いため、スクリーニングやジェノタイピングアッセイなどPCR増幅の結果が必要とされるアプリケーションには理想的です。

QuickExtract DNA Extraction Solutionは、毛嚢から培養細胞まで、幅広いサンプルタイプに適しています。いくつかのサンプルタイプはより挑戦的な性質のために、難しいサンプルを扱うために追加のQuickExtractキットが開発されました。 QuickExtract FFPE DNAキットは、ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)サンプルに有機溶媒を使用する面倒な抽出手順を不要にします。 QuickExtract Plant DNA Extraction Solutionは、エンドポイントPCRとリアルタイムPCRの両方で、葉の組織から植物ゲノムDNAを迅速に抽出することを可能にします。このwhite paperでは、QuickExtract DNA Extraction Solutionのさまざまな用途を表す公開済みアプリケーションの概要について説明します。

CRISPR-Cas遺伝子編集

CRISPR-Cas技術の急速な発展のおかげで、生体内の遺伝子に的を絞った正確な変更を加えることができるようになりました。この技術は、侵入したウイルスから外来DNAを認識して破壊するためにCRISPR-associated(Cas)ヌクレアーゼと一緒にクラスター化された規則的に散在した短いパリンドロームリピート(CRISPR)を使用する細菌性免疫防御メカニズムに由来します。いくつかのタイプのCRISPR-Casシステムが同定されており、そのうちCRISPR-Cas9システムが最も一般的に使用されています。

典型的には、外来DNAは細菌内で断片化されてCRISPR配列に組み込まれます。CRISPR遺伝子座が転写されると、転写物はより小さいCRISPR RNA(crRNA)にプロセシングされます。細菌のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と組み合わせて、これらのcrRNAは将来の感染の間にバクテリオファージDNA中の相補的配列を標的としそして切断することができます。

ゲノム編集技術は、CRISPR-Cas9システム中の比較的少数の成分を利用すします。crRNAおよびtracrRNAの配列はしばしば単一ガイドRNA(sgRNA)にまとめられます。sgRNAおよびCas9をコードする配列は、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質導入するために使用される単一のベクターに組み込むことができます。あるいは、精製されたCas9および転写されたガイドRNAを複合体化し、そしてリボ核タンパク質(RNP)として宿主細胞に送達することができます。細胞内に入ると、ガイドはCas9活性を特定の遺伝子座に向けます。Cas9活性は二本鎖切断(DSB)をもたらし、これはエラーを起こしやすい非相同末端結合(NHEJ)経路によって修復されるであろう。この種の修復はしばしば標的部位に挿入および/または欠失(インデル)突然変異を生じます。sgRNAおよびCas9配列が「修復テンプレート」を用いて細胞に送達される場合、細胞は相同指向修復(HDR)と呼ばれる代替の修復機構を使用します。修復テンプレートは、遺伝子座を特定の様式で改変することができるように挿入されるべきDNA配列を含みます。次いで、修飾された標的配列を、典型的にはPCRに基づくスクリーニングまたは次世代シーケンス(NGS)によって検証します。

突然変異のスクリーニング

任意の遺伝子編集方法の重要な部分は、手順の成功および効率を確認するための突然変異細胞および野生型細胞のスクリーニングである。この目的のためにいくつかのアッセイが開発されてきました。これらのうち、酵素ミスマッチ切断(EMC)アッセイは、CRSPR-Casベースの方法において広く使用されています。最初のEMCアッセイでは、バクテリオファージリゾルターゼ酵素T4エンドヌクレアーゼVII [1]およびT7エンドヌクレアーゼI [2]を使用しました。その後、植物ベースのS1ヌクレアーゼが導入され、この技術は現在Integrated DNA Technologies(IDT)のSurveyor突然変異検出アッセイのラインで商品化されています。

典型的なEMCアッセイでは、ゲノムDNAは野生型および突然変異型対立遺伝子を含む細胞の集団から単離されます。標的領域はPCRによって増幅され、次いで変性されそして再アニーリングされます。このプロセスは、野生型および変異型配列のクロスアニーリングのために、標的部位でミスマッチ二本鎖を生じます。歪んだ二本鎖DNAを選択的に切断するT7エンドヌクレアーゼIによるアンプリコンの消化に続いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるDNA断片の分析が行われます。

EMCアッセイ用のゲノムDNAを調製するためのQuickExtract DNA Extraction Solutionの使用は、もともとジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)によって導入された変異についてスクリーニングすることが報告されました[3]。このアッセイは、集団内で〜1%の遺伝子改変に敏感であり、著者らはZFNに基づく遺伝子編集のための他の変異検出法に勝る利点としてそのスピード、低コスト、および便利さを挙げています。

その後、マサチューセッツ工科大学のFeng Zhang博士の研究室は、QuickExtract DNA Extraction Solutionで単離したゲノムDNAを使用して、CRISPR-Cas9遺伝子編集後の突然変異検出のための標準EMCプロトコルを開発しました[4]。 QuickExtractワークフローのスピードとシンプルさは、拡張性があり、費用効率が高く哺乳動物細胞におけるゲノム編集のためのアッセイに貢献します。

ゲノム規模のノックアウト

Joung et al. [5]は、さまざまなヒトおよびマウス細胞株においてCRISPR-Cas9を使用してプールされたゲノム規模のノックアウトまたは転写活性化スクリーニングを実施するためのシステムを記載しています。彼らは、プールされたときにゲノム規模の標的化のためのsgRNAライブラリーを構成する可変sgRNAを含むプラスミドを構築しました。システムフォーマットは、sgRNA、Cas9および他の必要な成分を同じプラスミド上または、別々のプラスミド上のいずれかにコードし得られました。sgRNAライブラリーをレンチウイルスにパッケージングし、研究中の細胞株に形質導入しました。細胞に選択圧を加えた後、得られた集団をsgRNA分布の変化についてNGSによってスクリーニングし、その結果から、多数の候補標的遺伝子を検証のために選択しました。目的の候補遺伝子を標的とする検証sgRNAのクローニングおよびレンチウイルスパッケージングの後、これらの選択されたsgRNAを細胞に形質導入しました。細胞がコンフルエントに達したら、96ウェルプレートでQuickExtract DNA Extraction Solutionを使用してゲノムDNAを抽出し、sumina RNA配列を含む領域を2段階PCRで増幅し、IlluminaRプラットフォームでのターゲットNGSによる初期検証を行いました。研究者らは、彼らの方法は機能喪失および機能獲得スクリーニングのために設計されているが、それは他のタイプのスクリーニングにも同様に使用できると報告しています。

遺伝子編集効率の向上

ヒト多能性幹細胞(hPSC)を用いた研究は、ヒトの発生、ならびに疾患の進行および治療的介入の研究における一連の新規技術を可能にしました。CRISPR-Cas9技術がhPSCに特異的な標的突然変異を導入する能力は、この急速に拡大している研究分野に新たな次元を追加しました。Xie et al [6]は、hPSCにおけるノックアウト突然変異の生成のための、新規のエピソームベクターベースのCRISPR-Cas9システム(epiCRISPR)を記載していいます。このベクターは、真核生物において細胞分裂ごとに1回複製することを可能にするEpstein-Barrウイルス由来の成分を含み、Cas9およびsgRNAの持続的発現を可能にします。さらに、トランスフェクトされた細胞は、ピューロマイシン選択によって濃縮されます。epiCRISPRシステムは、カスタムデザインされたsgRNAパネルを使用して、遺伝子ノックアウトとゲノム欠失について別々の実験でテストされました。hPSCのトランスフェクションおよびピューロマイシン選択の後、QuickExtract DNA抽出溶液を用いてゲノムDNAを単離した。標的領域をPCRにより増幅し、精製し、そして制限断片長多型(RFLP)により分析しました。NGSを使用してオフターゲット効果も調べました。著者らは、epiCRIPSRシステムを用いた遺伝子ノックアウトの高効率およびインデル生成の最大100%の効率を、オフターゲット効果なしで報告しました。

対立遺伝子交換

CRISPR-Cas9法の大部分は遺伝子ノックアウトまたはノックイン実験に使用されていますが、対立遺伝子全体の交換は潜在的な治療への応用にとって魅力的です。Kelton et al [7]は、CRISPR-Cas9システムを使用して、マウス由来抗原提示細胞株における多型主要組織適合遺伝子複合体(MHC)遺伝子座を再プログラムするための概念実証法を提供すます。著者らは、2本鎖DNA鋳型として導入されたMHCドナーカセットとの置換を可能にする、MHC-1対立遺伝子(〜3.4kb)に隣接するDSBを導入するsgRNAと共にCas9を使用しました。MHCドナーDNAの挿入を確認するために、候補細胞をQuickExtract DNA Extraction Solutionで処理し、分析のためにMHC遺伝子座の推定切断部位をカバーするプライマーを用いてゲノムDNAを増幅しました。著者らは、彼らのアプローチが天然の遺伝子座で大型のMHC対立遺伝子を置換することの実現可能性を実証していると結論付け、同種細胞移植におけるMHCミスマッチを修正するためのその将来の有用性を示唆しました。

TALEN

CRISPR由来の遺伝子編集方法の標的外効果についての懸念が、一般的に高い標的特異性を提供するTALENへの新たな関心を刺激しています。Wangら[8]はTALENデザインを最適化し、ヒト培養細胞株、ならびにヒト胚性幹細胞(hESC)でそれらの方法をテストしました。この方法は、効率的な遺伝子編集のために最適化されたTALENと一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)を組み合わせたものです。最適化されたTALENの切断効率は、TALENプラスミドによるトランスフェクション後の細胞をQuickExtract DNA Extraction Solutionで処理し、Surveyorヌクレアーゼアッセイを用いて遺伝子修飾の割合を分析することにより、HEK293T細胞において検証されました。その後の実験により、ヒト腫瘍細胞株および2つのマイクロRNA遺伝子、miR-21およびmiR9-2のホモ接合性欠失を有するhESCが確立されました。著者らは、TALEN-ssODN法の多様性が治療的応用におけるその有用性に寄与し得ることを示唆しています。

ジェノタイピング

QuickExtract DNAワークフローのスピードにより、二枚貝からマウスまで、さまざまな生物におけるPCRベースのジェノタイピングが可能になりました。

ムール貝

Fergusonら[9]は米国オハイオ州の3つの分水界地点からの淡水イガイLampsilis cardiumの個体群構造、分散能力、および繁殖戦略を特徴付けました。成体ムラサキイガイからPureGeneキット(Gentra)を用いて、またエタノール保存ウキクサ(イガイ幼虫)からQuickExtract DNA Extraction Solutionを用いてゲノムDNAを抽出しました。QuickExtractでの抽出方法を、65℃で30分、続いて98℃で7分と両方の加熱工程で時間を延長し修正しました。抽出されたDNAを、関連性および親子関係の集団内パターンと比較して局所的集団構造を評価するために、12個のマイクロサテライト遺伝子座に対するプライマーを用いたPCRにおいて使用しました。この研究は、このイガイ種で観察された長距離受精が、潜伏した淡水イガイ個体群の回復の改善に影響を与える可能性があると結論付けました。

マウス

Gタンパク質共役微量アミン関連受容体1(TAAR1)は神経伝達物質および代謝産物によって刺激され、そしてこの受容体は薬物乱用の素因および関連する効果を含む多数の生理学的役割を有します。Shiら [10]はマウスのTAAR1遺伝子における一塩基多型(SNP)の機能的影響を研究しました。QuickExtract DNA Extraction Solutionを用いていくつかのマウス系統由来のゲノムDNAを耳または尾の組織から抽出し、SNP含有領域に隣接するプライマーを用いたPCRによって増幅しました。アンプリコンを精製し、そして配列決定を行いました。結果は、TAAR1変異体が機能的、亜機能的、および非機能的受容体の発現をもたらし、メタンフェタミンに対する反応は大きく異なることを示しました。著者らは、TAAR1中のSNPが、さまざまなヒト疾患に対する素因を決定するため、およびTAAR1特異的治療法を用いて治療を個別化するための有用なスクリーニングツールを提供できることを示唆しています。

トランスジェニックマウス

腫瘍特異的抗原(TSA)は、広範囲の癌における魅力的な治療標的を構成する。TSAとは異なり、腫瘍関連抗原(TAA)は正常細胞および腫瘍において様々なレベルで発現され、治療戦略をより困難なものにしていいます。Yongら[11]はTAAヒト上皮成長因子2(Her2)を調べました。これは正常な乳房組織で発現していますが、乳がんの15〜30%で上方制御されています。彼らはトランスジェニックマウスモデルを用いて、腫瘍細胞中のHer2抗原を特異的に標的とする治療法を調べた。ヘテロ接合型Her2+/-マウスは野生型マウス(Her2-/-)と同様の様式で発生するように見えるが、潜在的に胚致死性のために、ホモ接合型Her2+/+マウスを作製することは困難であることが証明されています。QuickExtract DNA Extraction Solutionを用いてHer2 +/+、Her2 +/-およびHer2 -/- マウスの尾部からゲノムDNAを抽出し、続いてPCRを行ってHer2導入遺伝子の組み込み部位を調べた。その後の全ゲノム配列決定により、Her2導入遺伝子の組込み部位が、胚発生に関係している姉妹の早発性解離(Pds5b)をコードする遺伝子への挿入のために、確かに胚致死の原因であることが確認されました。

結論

QuickExtractメソッドのスピードと利便性は、遺伝子編集とジェノタイピングのワークフローにおける中間段階でのPCR検証に理想的です。QuickExtract法では、迅速で自動化に適したプロセスで多数のサンプルをスクリーニングすることができます。PCRベースのスクリーニングを必要とする用途におけるQuickExtract DNA Extraction Solutionの有用性は、IDT(Alt-R™ゲノム編集検出キット、プロトコルCRS-10056-PR)とNew England Biolabs(EnGen® Mutation Detection Kit, technical manual E3321)によって提供される標準のCRISPR-Cas9遺伝子編集プロトコルへの組み込みによって認知されています。

References

  1. Youil R et al. 1995. Screening for mutations by enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII. Proc Natl Acad Sci USA 92:87-91.
  2. Mashal RD et al. 1995. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nat Genet 9:177-183.
  3. Guschin DY et al. 2010. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol 649:247-256.
  4. Pyzocha NK et al. 2014. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Methods Mol Biol 1114:269-277.
  5. Joung J et al. 2017. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc 12:828-863.
  6. Xie Y et al. 2017. An episomal vector-based CRISPR/Cas9 system for highly efficient gene knockout in human pluripotent stem cells.
    Sci Rep 7:2320.
  7. Kelton W et al. 2017. Reprogramming MHC specificity by CRISPR-Cas9-assisted cassette exchange. Sci Rep 7:45775.
  8. Wang X et al. 2014. Precise gene modification mediated by TALEN and single-stranded oligodeoxynucleotides in human cells. PLoS ONE 9:e93575.
  9. Ferguson CD et al. 2013. Population structure, multiple paternity, and long-distance transport of spermatozoa in the freshwater mussel Lampsilis cardium (Bivalvia:Unionidae). Freshwater Sci 32:267-282.
  10. Shi X et al. 2016. Genetic polymorphisms affect mouse and human trace amine-associated receptor 1 function. PLoS ONE 11:e0152581.
  11. Yong CSM et al. 2015. Embryonic lethality in homozygous human Her-2 transgenic mice due to disruption of the Pds5b gene. PLoS ONE 10:e0136817.

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