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Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kit
- RNAサンプルから二本鎖RNA（dsRNA）を除去する、スケーラブルで使いやすい酵素による除去
- HPLCのようなクロマトグラフィーを必要とせずにdsRNAを除去します
- 一本鎖RNA（ssRNA）の収量は低下しません。
- 細胞内のmRNAに対する自然免疫原性反応を低減します。
製品概要
Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kit は、IVT反応により合成されたRNAサンプルに含まれる二本鎖RNA（dsRNA）のコンタミネーションを除去する新しい酵素ソリューションを提供します。1キット（25反応）で1,500 μgのIVT RNA、またはmRNAを処理します。
mRNAサンプルからdsRNAを除去することは、細胞内のmRNAに対する自然免疫原性反応を低下させるために不可欠であることが示されています1-4。逆相HPLC5、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー6、セルロースクロマトグラフィー7などの代替的なdsRNA除去法は、一本鎖RNA（ssRNA）の収率を低下させるだけでなく、高い設備投資を伴います。Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kitは、一本鎖RNA収量を減少させることなく、IVTまたはmRNA調製中のdsRNAを除去する、使いやすくスケーラブルな方法を提供します。
References:
- Kariko, K. et al., (2011) Nucleic Acids Res. 39, e142.
- Schlee, M., Hartmann, G., (2016) Nat. Rev. Immunol. 16, 566.
- Pardi, N. et al., (2018) Nat. Rev. Drug Discov. 17, 261.
- Mu, X., Hur, S., (2021) Acc. Chem. Res. 54, 4012.
- Weissman, D. et al., (2013) Methods Mol. Biol. 969, 43.
- Kalmakoff J., Payne C.C., (1973) Anal. Biochem. 55, 26.
- Baiersdorfer M. (2019) Mol. Ther. Nucleic Acids. 15, 26.
製品性能
dsRNA の減少
Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kitで処理した1.4 kbのシュードウリジン含有RNAサンプルを未処理のサンプル (Figure 1、右パネル)およびdsRNA標準品 (Figure 1、左パネル)と比較しました。各サンプルとスタンダードの3倍量を荷電ニトロセルロースメンブレンに固定化し、dsRNA-特異一次抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体で免疫ブロッティングした。シグナルはSyngene® G:Boxで強化化学発光を用いて検出しました。左側のdsRNA標準曲線を用いて回帰式が作成され、ブロットの右側に表示されている処理サンプルと未処理サンプルの両方に存在するdsRNAのパーセンテージを算出するために使用されました。結果は、Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kitで処理した後はサンプルのdsRNA含有量が、このアッセイの検出限界（0.005%）以下のレベルまで減少したことを示しています。
Figure 1.Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kit処理RNAのイムノブロット
dsRNAは処理後、検出限界以下に減少している。
RNA内の内在性安定dsRNA領域の処理
Min-Immune™ Gold dsRNA除去キットは、IVT RNAおよびmRNA試料の転写過程で生成される汚染dsRNAを除去するように設計されています。ただし、一部のRNAには自然にdsRNA領域や構造が含まれています。これらのdsRNA領域の長さは、Min-Immune™ Gold RNase IIIによる切断に対する感受性および細胞内dsRNA特異的パターン認識受容体による認識に影響を与えます。一般に、Min-Immune™ Gold RNase IIIは、ウリジン含有RNAでは17 bpから、シュードウリジン含有RNAでは22 bpからヘアピン構造を認識します。消化効率はヘアピン構造の長さが長くなるほど向上します（Figure.2）。このため、同じRNAの大量処理を行う前に、新しいRNAサンプルのMin-Immune™ Gold処理を1Xまたはそれ以下の反応で特性評価することを推奨します。
Figure 2 7つのコンストラクトを、RNAの二次構造において12〜26塩基対（bp）の長さのヘアピン構造を持つ内在性dsRNA領域を含有するように設計しました。標準的なヌクレオシド（GAUC、左パネル）または修飾ヌクレオシドのシュードウリジン（GAΨC、右パネル）を用いて転写を行った後、RNAサンプルはMin-Immune Gold dsRNA除去キットで処理され、ホルムアルデヒド変性1%アガロースゲル上で可視化しました。GAUC-RNAでは15bp以下のdsRNA二重鎖はMin-Immune Gold RNase IIIによって認識されず、GAΨC-RNAでは19bp以下のdsRNA二重鎖は認識されませんでした。
RNAの一時的なdsRNA領域の処理
一部のRNAサンプルは、反応中に一時的なdsRNA領域（分子呼吸）を形成することがあり、これらはMin-Immune™ Gold RNase IIIの切断基質となります。これらの領域は、ゲル上で可視化されると、淡い、全長に満たない背景バンドとして現れます（図3）。この切断は、処理されたRNAの全体的な機能に影響を及ぼしません。軽微な切断が発生した場合、その後のRNAサンプルは、インキュベーション時間を短縮するか、Min-Immune™ Gold RNase IIIの使用量を減らすことで、より穏やかに処理できます。
図3. シュードウリジンを含むmRNAサンプル（Ψ-mRNA）をMin-Immune Gold dsRNA除去キットで処理し、ホルムアルデヒド変性1%アガロースゲルで可視化しました。一時的なdsRNA部位の切断による淡いバックグラウンドバンドは、画像を意図的に過曝露することで確認できます。この切断は、処理されたRNAの全体的な機能に影響を及ぼしません。
| 製品名 | Cat.No. | サイズ |
| Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kit | MGDR250125 | 25反応 |
キット内容：
- Min-Immune™ Gold RNase III (20X)
- Min-Immune™ Gold 10X RNase III Treatment Buffer
- ScriptGuard™ RNase Inhibitor, 40 U/μl
- 5 M Ammonium Acetate
- RNase-Free Water
Min-Immune™ Gold dsRNA Removal Kitは研究用途での使用に限られています。商用利用の場合にはお問い合わせください。