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Exonuclease III, E. coli
アプリケーション
- 部位特異的変異導入に用いる中間体の調製1〜3
- 鎖特異的放射標識プローブの調製4
Exonuclease IIIは二本鎖DNAをニック、平滑末端または3’陥没末端から3’→5’方向に分解して、反対側の鎖にssDNAの領域を生じます5,6。Exonuclease IIIによるDNAの分解は規定の反応条件下では一定の速度で進み、予測可能かつ再現可能な結果が得られます。 Exonuclease IIIによるデオキシリボヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ様切断速度は、温度、イオン強度、テンプレートの配列、酵素-DNA比などの反応要因に依存するため4,7、望みの切断速度を得るには、各テンプレートに関して予備的な分解実験を行い、条件を最適化する必要がありあます。 Exonuclease IIIは4塩基以上の3’突出末端、ssDNAまたはチオエステル結合したヌクレオチドに対して活性を示しません2．この酵素には固有のRNase H活性、3’DNAホスファターゼ活性および脱プリン部位DNAエンドヌクレアーゼ活性もあります1,6。
- ユニットの定義
- 標準的な条件下、37℃で30分間に二本鎖仔ウシ胸腺DNAから1 nmolの酸可溶性ヌクレオチドを放出するExonuclease III活性を1単位とする。
- 保存バッファー
- 50 mM Tris-HCl (pH7.5)、0.1 M NaCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.1% Triton® X-100を含む50%グリセロール溶液
- Exonuclease III 10X反応バッファー
- 330 mM Tris-酢酸(pH7.8)、660 mM 酢酸カリウム、100 mM酢酸マグネシウム、5 mM DTT
- 品質管理
- Exonuclease IIIは、検出可能な外来性RNase活性、エンドヌクレアーゼ活性および一本鎖エキソヌクレアーゼ活性がないことを確認しています。
- 至適温度/温度不活性
- 至適温度：37℃
温度不活性：65℃、10分
参考文献
- Sambrook, J. et al. (1989) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- Vandeyar, M.A. (1988) Gene 65, 129.
- Luckow, B. et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 417.
- Richardson, C.C. et al. (1964) J. Biol. Chem. 239, 251.
- Weiss, B. (1976) J. Biol. Chem. 251, 1896.
- Rogers, S.G. and Weiss, B. (1980) Meth. Enzymol. 65, 201.
- Guo, L.H. and Wu, R. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 2065.