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EpiScript™ Reverse Transcriptase
Applications
- PCR もしくは、real-time PCRのためのFirst-strand cDNA合成
EpiScript™ Reverse Transcriptase (EpiScript RT)は、RNase H活性を低減させた組み換えのMMLV逆転写酵素でSuperScript® II RTの代替となります。EpiScript RTは、高効率で長鎖のRNAテンプレートからの完全帳cDNAの合成することができます。EpiScript RTは、他のMMLV RTよりも大幅に高い活性を示します。50 pgのtotal RNAよりcDNAが合成可能で、Real-Time RT-PCRや他のアプリケーションに使用できます。
EpiScript RTは、200 U/µl で10,000 unitと25,000 unitサイズで提供できます。10X Reaction bufferと100 mM DTTが酵素に付属します。
Storage Buffer: EpiScript RTは、50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM sodium chloride, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, and 0.1% Triton® X-100を含むis supplied in a 50%グリセロール溶液で提供されます。
Unit Definition: 飽和量のoligo(dT)が結合しているpoly(A)をテンプレートとして使用して37℃、10分で1 nmolのdTTPを酸不溶物への取り込むEpiScript RT活性を1ユニットととする。
Contaminating Activity Assays: EpiScript RTは、検出可能なエキソヌクレアーゼ活性、エンドヌクレアーゼ活性、RNase活性がないことを確認しています。
Figure 1. EpiScript™ RTは、2nd strand-qPCR反応において他社と同等もしくはそれ以上のパフォーマンスを示します。
1st-strand合成反応は、製造者の仕様に基づき組み合わせました。インプットRNAは、1 µgのJurkat total RNA (Ambion®)を使用しました。反応は50 ng poly-T(16-18) DNAを用いました。 2nd strand qPCRはBio-Rad社iQ SYBR mastermixと、250-350 bpのアンプリコンが得られるgene-specific primerを使用しまし、4回繰り返し行われました。 PGDF-R (Platelet Derived Growth Factor Receptor), TNF (Tumor Necrosis Factor), IL-1b (Interleukin-1 beta), IL-2 (Interleukin 2)。 Image courtesy of Matthew Kellinger, Illumina® Inc.
Figure 2 . EpiScript™ RTは、転写産物の長さに依存せず似たtranscript coverageを示します。
EpiScriptは、 total RNAとoligo-dT (上側)、もしくは polyA+ RNAとrandom hexamers (下側)を用いてfirst strand cDNAを合成しました。cDNAは、 Illumina®-compatible librariesに変換されシーケンスされました。Readsは、様々な長さのクラスに基づきtranscriptに整列され、read densityをtranscriptの5’末端からの距離パーセントでプロットしています。0%は5´末端、100 %は3’末端を示します。oligo-dT primingは、random primingより3’バイアスを示します。
Figure 3. インプット量によらず、EpiScript™ RTは、 first strand cDNA合成において同様のtranscriptカテゴリーを示します。
EpiScript RT は、5 ngもしくは、50 pg human total RNAとrandom primerを使用し、 cDNAはIllumina社シーケンスライブラリーに変換されました。ReadsはTophatを用いて整列され、Cufflinksでアノテーションされ、各カテゴリーを円グラフにてパーセント表示しました。