XDel ノックアウト細胞プール/クローン（マルチガイドデザイン）

画期的な研究成果を実現する高性能ノックアウト細胞

XDel CRISPR Technologyについて

XDelは、煩わしい遺伝子編集作業を排除するための最先端のCRISPRノックアウト技術です。革新的なガイドRNA設計戦略を活用することで、XDelは高効率で一貫性があり再現性のある遺伝子ノックアウトを実現し、研究者が自信を持って発見を加速できるよう支援します。

遺伝子機能研究、疾患モデル化、または医薬品開発のいずれを行う場合でも、XDelは信頼性の高い結果を提供し、意味のある洞察を導き出します。

• 高効率：標的遺伝子編集率の向上と一貫したノックアウト性能を実現
• 信頼性の高い結果：機能アッセイで検証された持続的なタンパク質欠損効果を体験
• 再現性：機能喪失研究における実験間で変動を最小限に抑え、信頼性の高い結果を実現

XDelは、単一ガイド法と比較してより高い精度と一貫性のある標的部位編集を実現し、優れた編集性能を提供します。伝統的な単一ガイド法によるノックアウトでは、標的部位編集の効率が広範囲で予測不能な変動を示すのに対し、EditCo社 XDel技術は一貫した高パフォーマンスで際立っています。XDelは、多様な細胞株において信頼性の高い結果を提供し、効率と再現性の両面で単一ガイド法を上回る性能を発揮します。

Figure 1. XDelの複数gRNAによるオンターゲット編集効率は、単一ガイドRNA法と比較して著しく高く、かつ一貫性があります。7つの内在性標的遺伝子座において、2つの不死化細胞株（IMM）と2つのiPSC細胞株にトランスフェクションを行った結果、マルチガイド（ピンクのバー）とそれぞれの3つの単一ガイドRNA（ブルーのバー）のオンターゲット編集効率を比較すると、XDel技術は単一ガイドRNA手法に比べて著しく高いかつ一貫したオンターゲット編集効率を提供することが示されています。 各トランスフェクションは3回繰り返し実施され、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。 XDel技術は、単一ガイド編集と比較して、標的遺伝子編集の効率を最大化し、非標的効果を最小化します。 単一ガイドRNA戦略では、異なる用量で編集効率が変動する傾向がありますが、EditCoのXDel技術は、低用量濃度でも一貫して高い標的遺伝子編集効率を実現します。この再現性は、XDel技術の堅牢性を示しており、単一ガイドアプローチで見られる用量や位置の影響に左右されず、信頼性の高い結果を提供します。XDel gRNA設計は、優れた再現性のある編集性能を確保し、追加の最適化を必要とせずに研究に集中できる環境を提供します。

Figure 2. XDelの複数ガイドRNAによるオフターゲット編集効率は、単一ガイドRNA法と比べて著しく低くなります。 XDel細胞（ピンクの棒グラフ）の3つの単一ガイドオフターゲットサイトにおけるオフターゲット編集効率と、それぞれに対応する3つの単一ガイドRNA（青い棒グラフ）の63のオフターゲットロケーションにおける効率を比較した結果 （7つのオンターゲットサイトごとに3つのオフターゲットロケーションをテスト）を、2つの不老不死化（IMM）細胞株と2つのiPSC細胞株にトランスフェクションした結果、XDel細胞はシングルガイドと比較して著しく低いオフターゲット編集効率を示すことが示されました。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

Figure 3. XDelの複数ガイドRNA編集効率は、単一ガイドRNA法と比較してgRNA濃度を低下させても高いまま維持されています。 トランスフェクションされたHEK293細胞における複数ガイド（左）と単一ガイド（右）およびSpCas9を用いたRNP濃度増加（0.25X、 1X、4X）で7つの内在性サイトにおけるオンターゲット編集効率と、63のオフターゲットサイトにおけるオフターゲット編集効率（積み重ねた灰色バー）を比較すると、XDel細胞はシングルガイドと比較して、最小のオフターゲット効果で高いオンターゲット編集効率を維持することが示されています。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel細胞プールは、複数の細胞継代にわたって持続的な遺伝子ノックアウトを示します。

Figure 4. 複数の細胞継代を通じて高い編集効率が維持されます。EditCoのマルチガイド設計を使用し、1つの標的遺伝子あたり最大3つの改変gRNA（6つの遺伝子にわたる）をSpCas9と結合させ、RNPをU2OS細胞にトランスフェクションしました。トランスフェクション後、異なる時間点および最大4回の継代において編集効率を測定しました。各標的遺伝子における中央値の編集効率は85％を超えています。

XDelを使用することで、培養回数を重ねても細胞の生存率が維持されます。

Figure 5. U2OS細胞において、細胞の生存率は複数の細胞継代を通じて維持されています。生存率はCeligoを使用して測定されました。CDK9は共通の必須遺伝子であるため、継代に伴い生存率と細胞数が低下する傾向が見られます。

XDelノックアウト細胞プールは持続的なタンパク質欠損を示し、機能アッセイにおける直接的かつ信頼性の高い使用を可能にします。

Figure 6. マルチガイド技術を用いた編集済み細胞プールは、持続的なタンパク質欠損を示します。これにより、これらの細胞プールを機能解析に直接かつ信頼性高く使用することが可能になります。5つのノックアウト標的遺伝子に対するウェスタンブロット解析では、3つの指定された時間点（7日、14日、21日）において、陰性対照と比較してタンパク質が完全に欠損していることが示されました。標的遺伝子に対するノックアウト細胞プールは、U2OS細胞にマルチガイドsgRNAとCas9（RNPとして）をヌクレオフェクションにより導入することで生成されました。各標的に対して、非標的sgRNAを用いた陰性対照プールもトランスフェクションされました。

XDel 戦略はどのように機能するのでしょうか？

従来の CRISPR ノックアウト手法は、多くの場合、SpCas9 と連携して、標的切断部位にさまざまな挿入または欠失（インデル）を生成する単一のガイド RNA に依存しています。このアプローチは予測不可能な場合があり、編集結果にばらつきが生じ、ノックアウトが不完全になることがあります。EditCo のスマートな情報科学により、1 つの対象遺伝子に最大 3 つの sgRNA をターゲットとするマルチガイド設計が生成されます。ガイドは空間的に調整され、協調してガイド付き修復を誘発し、初期エクソンで断片の欠失をもたらします。これにより、他のプール戦略と比較して最も信頼性の高いノックアウト戦略となっています。