HiBiT-Tag、Halo Tag^® and NanoLuc^®ノックイン細胞

HiBiT Protein Tag

スケーラブルなリアルタイム内在性タンパク質解析

生物学的正確性： 内在性タンパク質を容易に標識しながら、自然な機能と局在性を維持 高感度： 生細胞または溶解細胞において、低発現タンパク質でも一貫して検出可能で、定量的な結果を得られます スピードと拡張性： 必要な数のカスタム編集済み、発光検証済み細胞株を、最短7週間で入手可能です 柔軟性と信頼性： ご希望の細胞株とタンパク質、EditCo社の保証と専門知識で、研究を前進させます

カスタムデザイン。CRISPRの精度。シームレスなデリバリー。

HiBiTは、タンパク質の機能や局在を妨げることなく、内在性タンパク質の発現をリアルタイムで定量的に測定可能な11アミノ酸のTagです。PromegaのLgBiTとNano-Glo^®検出システムと組み合わせることで、EditCoの堅牢なHiBiTタグ付きCRISPRノックインは、細胞を強力なバイオセンサーに変換します。これは、薬物発見、細胞ベースのアッセイ、タンパク質定量に最適です。
EditCo社の専門家チームは、ご指定の遺伝子、細胞株、挿入部位のご選択（C末端、N末端）に基づいて、精密なノックイン戦略を設計します。RNPエレクトロポレーション法と合成ガイドを使用し、外因性DNA要素を導入することなく編集効率を最大化します。
細胞は、クローン単位または平均ノックイン効率70%を超える高効率プールとしてご提供可能です。

-タンパク質局在化研究： 細胞内タンパク質のリアルタイム追跡を行い、タンパク質が細胞小器官内でどのように移動するかを理解します。タンパク質の局在と機能の関連性を解明します。 -細胞株の生成： 高スループット薬物スクリーニングや薬物標的検証用にTag付き細胞株を作成し、タグ付き内在性タンパク質に対する薬物の影響をリアルタイムで観察します。 -タンパク質間相互作用のマッピング： 標的タンパク質にTagを付与し、タンパク質が他の分子と複合体を形成する仕組みを解明し、シグナル伝達、調節、細胞プロセスへの貢献を明らかにします。 -タンパク質定量： さまざまな刺激、疾患状態、または遺伝的変異に対する発現や分解を追跡し、基盤となる経路やメカニズムを理解します。

様々な比較

カスタム編集済みHiBiT Tag付き細胞株
自作しますか、購入しますか？タンパク質をTag付けするより良い方法
EditCo社は、不老不死化細胞とiPS細胞の両方に対して、規模や予算、遺伝子の人気度に関わらず、包括的なカスタマイズと信頼性を提供します。他のHiBiT Tag付きノックイン細胞株は、ご自身によるTag付きタンパク質の設計と編集での負担よりも簡単な解決策を提供しますが、しばしば制限やサポートのレベル、柔軟性、保証の変動があります。

納品物	特徴
編集済み細胞プールまたはクローン（1バイアルあたり50万細胞を含む2バイアル） Mock-トランスフェクション済み細胞プール（1バイアルあたり50万細胞のバイアル2本） 合成sgRNAの配列 NGSシーケンスに使用されたプライマー配列 拡張後の各編集済みプールに対するNGSシーケンス解析レポート。 マイコプラズマ検査（陽性/陰性）、パッセージ数、追加の品質管理（QC）解析を含む総合的なQCレポート	細胞ソース ・EditCo 提供 CRISPR 設計 ・合成改変 sgRNA（標準） ・ドナー ssODN（標準） 追加オプション ・QC：ルミネセンス シーケンス納品物に関する注意事項：ヒト/マウス以外の細胞タイプの場合、編集されたプールまたはクローンからのサンガーシーケンスデータとノックインシーケンスとのアラインメントが提供されます。

CRISPRノックインを用いたタンパク質濃度、内取り込み、および調節のモニタリング

調節されたタンパク質濃度の測定
細胞内のタンパク質濃度は、環境信号や治療介入に応じて変化します。これらの変化を測定することは、生物学や薬物応答を理解するために不可欠です。標的タンパク質分解の台頭は、特に従来「薬物化不可能」とされていた標的に対して、新たな薬物発見のモダリティを可能にしました。

CRISPR/Cas9を用いて、内在性遺伝子座にHiBiTのような生物発光タグを挿入することで、研究者は抗体や過剰発現を必要とせずにタンパク質濃度を精密に定量できます。これらのアッセイは高感度でスケーラブルであり、エンドポイント形式とライブセル形式の両方と互換性があり、天然のタンパク質動態をリアルタイムで把握するのを可能にします。

内因性Tag付けにより、HIF1Aの量測定アッセイの感度が向上しました。HeLa細胞は、Hif1a-HiBiTの発現を制御するCMVまたはPGK駆動型発現ベクターを異なる量で一過性転写しました。または、CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いて、HeLa細胞の内因性遺伝子座にHiBiTをTag付けしました。細胞は、指示された濃度の1,10-フェナントロリンで処理され、タンパク質量はその濃縮度に応じて測定されました。測定にはNano-Glo^® HiBiT Lytic Reagentが使用されました。(Source: https://www.promega.com/applications/small-molecule-drug-discovery/crispr-cas9-knock-in-tagging/

PROTAC処理後の内在性HiBiT-BRD4の分解キネティクス。HiBiTは、HEK293 LgBiT細胞株の内在性BRD4遺伝子座に挿入されました。細胞は、Nano-Glo^® Endurazine™質を含むCO₂非依存性培地中で、MZ1の濃度勾配処理を受けました。発光は、GloMax^® Discoverマイクロプレートリーダーでリアルタイムに測定されました。(Source: https://www.promega.com/applications/small-molecule-drug-discovery/crispr-cas9-knock-in-tagging/

細胞表面受容体の内取り込み

多くの細胞表面受容体は、リガンド結合に伴い、その自然なシグナル伝達サイクルの一環として内取り込みされます。CRISPR/Cas9を用いて受容体の細胞外末端にHiBiT Tagを挿入することで、抗体や過剰発現システムに依存することなく、内取り込みと再利用をリアルタイムでモニタリングできます。

化合物処理後の内在性膜受容体の内取り込みの定量化。CRISPR編集により内在性EGFR遺伝子座にHiBiTを挿入したHeLa細胞のプールを、指示されたようにEGFで処理しました。Nano-Glo^® HiBiT Extracellular Detection Systemを用いて、細胞表面に発現するHiBiT-EGFRを特異的に検出しました。(Source: https://www.promega.com/applications/small-molecule-drug-discovery/crispr-cas9-knock-in-tagging/

下流標的遺伝子の発現制御のモニタリング

上流のシグナル伝達イベントは、しばしば下流の遺伝子の発現に影響を及ぼします。CRISPR/Cas9を使用すれば、下流標的遺伝子の内在性ロカスにHiBiT Tagを挿入し、タンパク質発現の変化を直接測定できます。これらの生細胞アッセイにより、経路の活性が機能的なタンパク質出力にどのように変換されるかを過剰発現や複雑な抗体ワークフローを必要とせずにリアルタイムで追跡できます 。

上流の調節タンパク質の分解後にcMycレベルをモニタリングしました。急性骨髄性白血病のモデル細胞であるMV-4-11細胞は、CRISPR/Cas9を用いて内在性cMyc遺伝子座にHiBiTを挿入し、LgBiTを共発現するように編集されました。細胞内のcMyc遺伝子発現レベルはBETタンパク質によって正に調節されており、BETタンパク質ファミリーが失われると抑制が解除され、発現が低下するはずです。 BETタンパク質分解剤化合物dBET1とMZ1の投与後、cMycレベルをリアルタイムでモニタリングしました。BETタンパク質レベルの減少は、下流のcMyc標的遺伝子の発現低下を引き起こしました。
(Source: https://www.promega.com/applications/small-molecule-drug-discovery/crispr-cas9-knock-in-tagging/

Halo Tag^® and NanoLuc^®

スケーラブルでリアルタイムな内在性タンパク質解析をシンプルに

-ライブセル対応：内在性タンパク質の機能を妨げることなく、動的なリアルタイム細胞プロセスを追跡可能 -高感度・高特異性：低濃度ターゲットの正確な定量化を、最小限のバックグラウンドノイズで実現 -多様な応用可能性：多様な実験設計や研究ニーズに対応可能 -効率的なワークフロー：アッセイの複雑さと変動を最小限に抑え、再現性の高い解析や高スループット研究に最適化

クローンとしてまたは平均ノックイン効率が70%を超える高効率なプールとして利用可能な細胞

HaloTag^® ノックインでさらに探求
動的生物学のための多機能Tag挿入

HaloTag^® は、合成リガンドと共有結合で結合する自己標識タンパク質タグで、タンパク質の可視化や操作を、どのように、そしていつ行うかを精密に制御可能です。CRISPRを用いてHaloTag^®を内在性遺伝子座に挿入することで、EditCo社はタンパク質の機能に影響を与えることなく、その行動、相互作用、位置をネイティブ発現とリアルタイムで制御する機能を提供します。

高解像度顕微鏡からプルダウンアッセイや分解研究まで、HaloTag^®は多様な細胞環境におけるタンパク質の運命を研究するための強力なツールです。

なぜHaloTag®を選ぶべきでしょうか？

ライブセル対応 　蛍光色素と結合したTagタンパク質でリアルタイムイメージングが可能 共有結合型でカスタマイズ可能 　リガンドとの結合によりイメージング、精製、または分解に利用可能 高特異性 　バックグラウンドノイズが最小限で、天然タンパク質との交差反応なし デュアル機能 　同一細胞株内で検出と捕捉を組み合わせ可能 タンパク質運命制御 　HaloPROTACsまたはdTAGsと組み合わせて条件付きタンパク質分解を実現

タンパク質の局在化を可視化： 蛍光リガンドを用いたライブイメージングにより、細胞内でのタンパク質の移動経路とタイミングを追跡します。 タンパク質の精製を可能に： レジンベースの親和性リガンドを用いて、Nativeの細胞抽出液から内在性発現タンパク質を回収します。 タンパク質間相互作用の研究： HaloTag®プルダウン法を用いて、Native条件下での複合体構成内容や結合パートナーを同定します。 輸送と分解の定量化： 時間制御されたリガンド結合を用いたpulse-chase実験を実施し、内取り込みと分解をモニタリングします。 HaloTag®の使用タイミング（HiBiTまたはNanoLuc®との比較）

マルチプレックス法と免疫細胞化学

HaloTag^®融合タンパク質は、蛍光性HaloTag^®リガンドと免疫細胞化学を組み合わせることで、他の細胞内標的と併せて可視化可能です。生細胞にHaloTag^®対応の蛍光色素で標識した後、細胞を固定し、HaloTag^®特異的ポリクローナル抗体とスペクトル的に異なる二次抗体を組み合わせた抗体で染色します。この二重標識アプローチは、生体内のリガンド結合を検証し、シグナルの特異性を確保します。抗体がHaloTag^®タンパク質のみを認識するため、背景染色が最小限に抑えられ、固定サンプルにおけるクリアなマルチプレックスイメージングが可能になります。

HaloTag^®-p65融合タンパク質とHaloTag^®R TMRリガンド、およびAnti-HaloTag^®ポリクローナル抗体（pAb）の共標識。細胞は5μMのHaloTag^® TMRリガンドで15分間標識され、優しく洗浄した後、2μg/mlのAlexaFluor^® 488標識抗ウサギIgG（Invitrogen）と反応しました。最後に、細胞はDAPI（Vector Laboratories）で対比染色しました。画像は、ローダミンとAlexaFluor^® 488に適したフィルターセットを備えたオリンパスIX81蛍光顕微鏡で収集しました。パネルA. HEK293-p65-HT2細胞の細胞質（赤）標識（HaloTag^®R TMRリガンドによる）。パネルB. Anti-HaloTag^®R pAbによる細胞質（緑）の標識。パネルC. リガンドと抗体の結合活性の共局在化。パネルD. 赤と緑の蛍光を合成し、DAPI（青）で核を対比染色した画像。矢印は、HaloTag^®-p65の発現がほとんどまたは全くない稀な細胞を示しています。
(Source: https://www.promega.com/resources/technologies/HaloTag/protein-localization-imaging-trafficking-and-turnover

膜タンパク質の局在化と輸送の解析

膜結合タンパク質の局在化と内取り込みを追跡するため、これらのタンパク質にHaloTag^®を融合させ、細胞外に留まる蛍光リガンドで標識します。これらのリガンドは細胞透過性がないため、表面発現タンパク質にのみ選択的に結合します。HaloTag^®タンパク質とそのリガンド間の共有結合による相互作用により、固定化後や過酷な実験条件下でもシグナルが安定に維持されます。これにより、表面に保持された受容体と内取り込まれた受容体を確実に区別でき、タンパク質輸送と膜動態の詳細な解析が可能になります。

ライブセルにおける細胞表面HaloTag^®融合タンパク質の標識。パネルAとBは、b1-インテグリンのシグナル配列と単一トランスメンブレンドメインからなるHaloTag^®-ECS（細胞外表面）融合タンパク質を安定発現するHEK293細胞を、HaloTag^® Alexa Fluor 488リガンドで標識し、その後画像化したものです。パネルCとDは、HaloTag^®-EDG1（GPCR受容体）融合タンパク質を発現するU2OS細胞を、Alexa Fluor^® 660リガンドで標識し、その後画像化したものです。共焦点画像では、蛍光（パネルAとC）が細胞表面に限定されており、DIC/蛍光オーバーレイ（パネルBとD）でも明確に確認できます。画像は、適切なフィルターセットを使用してオリンパスFV500共焦点顕微鏡で生成されました。
(Source: https://www.promega.com/resources/technologies/HaloTag/protein-localization-imaging-trafficking-and-turnover

NanoLuc^® ノックインで優れた感度を実現
ATP非依存型ルシフェラーゼで、高感度かつスケーラブルな検出を実現

NanoLuc^® ルシフェラーゼは、比類ない発光性能を実現するために設計された次世代型小型（19.1 kDa）ルシフェラーゼです。ホタルやRenillaルシフェラーゼと比較して100倍以上の明るさを有するNanoLuc^®は、低濃度タンパク質や経路の活性化を、困難な生物学的システムにおいても高感度で検出可能です。

EditCo社のCRISPRノックインワークフローにより、内因性ロカスに挿入されたNanoLuc^®はネイティブレポーターとなり、過剰発現によるアーティファクトや複雑な検出試薬の必要なしに、クリーンで定量的なシグナルを提供します。

なぜNanoLuc®を選ぶべきでしょうか？

卓越した明るさ 　低発現システムでも超高感度な検出を実現 安定した発光型キネティクス 　エンドポイント測定やキネティクス測定に最適 ATP非依存型化学反応 　細胞の健康状態やエネルギー状態の影響を受けにくい 小型で干渉が少ない 　タンパク質の自然な機能と動態を保持 柔軟なフォーマット 　分泌型、細胞内型、または分割ルシフェラーゼ（NanoBiT）設計に対応