Gene Knockout Kits（マルチガイドデザイン）

ヒトまたはマウスにおけるタンパク質コード遺伝子のシンプルで信頼性の高いCRISPRノックアウトキット

高速データ取得： ガイドスクリーニングの試行錯誤を排除。Gene Knockoutキットを最短5日で出荷し、標準的なPCR増幅でノックアウト効率を迅速に確認できます。 高効率： ターゲット部位での編集率の向上と一貫したノックアウト性能を保証。

EditCo社 の遺伝子ノックアウトキットは、CRISPR によるノックアウトの効率を高めるために設計されました。従来の CRISPR ノックアウト戦略の非効率性に対処するため、EditCo社は、遺伝子の単一の初期エクソンを標的とする、あらかじめ設計されたガイド RNA (gRNA) のセットを開発しました。このセットは、標的となる断片の欠失を生成することで、編集効率を高めるために協調して機能します。

1 つの gRNA を使用して 1 つの部位にランダムなインデルを導入する、あるいは複数の gRNA を使用して異なる領域をランダムにターゲットとする従来のアプローチとは異なり、当社の方法は、遺伝子を確実に破壊する協調的な欠失を作成するように特別に設計されています。このアプローチにより、完全な機能的ノックアウトを生成する可能性が高まり、従来の戦略に伴う予測不可能性や非効率性が軽減されます。

さらに、その結果得られたノックアウト遺伝子断片は、標準的な PCR 増幅を用いて迅速かつ正確に定量化できるため、CRISPR ワークフローにシームレスに統合することができます。EditCo社の ICE ツールと Sanger シーケンシングを使用して、CRISPR 編集結果を数秒で分析します。
ICE分析についてはこちらをご参照ください。https://www.editco.bio/crispr-analysis

Figure 1. XDel設計には、単一の標的遺伝子に作用する最大3つの改変sgRNA（灰色バー）が含まれます。共トランスフェクションされた場合、これらのsgRNAは標的ゲノム領域で同時に二重鎖切断を引き起こし、その結果、1つまたは複数の21塩基対以上の断片欠失を引き起こします。

ヒトまたはマウス遺伝子用の遺伝子ノックアウトキット
EditCo社の遺伝子ノックアウトキットは、ヒトおよびマウス遺伝子（必須でない遺伝子を除く）に対して保証されています。複数のgRNAは、分解に耐性があり、細胞内免疫反応を引き起こさないように化学的に修飾されています。CRISPR実験を完了するには、トランスフェクション最適化キット、追加のコントロール、およびSpCas9ヌクレアーゼを追加してください。

XDelテクノロジーは一貫して断片欠失を引き起こします

Figure 2. XDel 複数の gRNA は断片欠失を引き起こします。個々の gRNA と XDel gRNA の編集効果は、樹状細胞（ヌクレオフェクションにより転送された）における 2 つの遺伝子標的（TNF、TLR4）で比較されました。編集効率は、MiSeqで標的部位のシーケンシングにより分析され、編集タイプ（indelなし、50bp以上の大規模欠失、50bp未満の小規模欠失、挿入）に基づいてシーケンシング結果が分類されました。データは、Dr. Marco Jost and Dr. Jonathan Weissman, University of California, San Francisco, and Dr. Amy Jacobson and Dr. Michael Fischbach, Stanford Universityによって生成されました。

XDelは、不老不死化細胞、iPS細胞、および一次細胞において、シングルガイドと比較してより高い一貫性のあるオンターゲット編集を実現します。

Figure 3. XDelの複数gRNAによるオンターゲット編集効率は、単一ガイドRNA法と比較して著しく高く、かつ一貫性があります。7つの内在性標的遺伝子座（既知の高オフターゲット編集部位を有する）において、2つの不死化細胞株（IMM）と2つのiPSC細胞株にトランスフェクションを行った結果、マルチガイド（ピンクのバー）とそれぞれの3つの単一ガイドRNA（ブルーのバー）のオンターゲット編集効率を比較すると、XDel技術は単一ガイドRNA手法に比べて著しく高く、かつ一貫性のあるオンターゲット編集効率を実現しています。各トランスフェクションは3回繰り返し実施され、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel技術は、単一ガイド編集と比較してオンターゲット遺伝子編集を最大化し、オフターゲット効果を最小化します

Figure 4.XDelの複数ガイドRNAによるオフターゲット編集効率は、高オフターゲットレベルが知られている内在性標的部位を標的とした場合、単一ガイドRNA法に比べて著しく低くなっています。XDel細胞（ピンクの棒グラフ）の3つの単一ガイドオフターゲット部位におけるオフターゲット編集効率と、それぞれに対応する3つの単一ガイドRNA（青い棒グラフ）の63のオフターゲット部位における効率を比較した結果 （7つのオンターゲットサイトごとに3つのオフターゲットロケーションをテスト）を、2つの不老不死化（IMM）細胞株と2つのiPSC細胞株にトランスフェクションした結果、XDel細胞はシングルガイドと比較して著しく低いオフターゲット編集効率を示すことが示されました。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

Figure 5.XDelの複数ガイドRNA編集効率は、単一ガイドRNA法と比較してgRNA濃度を低下させても高いまま維持されます。転染されたHEK293細胞における複数ガイド（左）と単一ガイド（右）およびSpCas9を用いたRNP濃度（0.25X、 1X、4X）における7つの内在性サイトでのオンターゲット編集効率と、63のオフターゲットサイトでのオフターゲット編集効率（積み重ねた灰色バー）を比較すると、XDel細胞はシングルガイドと比較して、オフターゲット効果を最小限に抑えながら高いオンターゲット編集効率を維持することが示されています。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel技術を用いた編集細胞は、複数の細胞継代にわたって持続的な遺伝子ノックアウトを示します。

Figure 6.複数の細胞継代を通じて高い編集効率が維持されます。EditCoのマルチガイド設計を使用し、1つの標的（6つの遺伝子にわたる）あたり最大3つの改変gRNAをSpCas9と結合させ、RNPをU2OS細胞にトランスフェクションしました。トランスフェクション後、異なる時間点および最大4回の継代において編集効率を測定しました。各標的における中央値の編集効率は85％を超えています。

XDelを使用することで、パッセージ間での細胞の生存率が維持されます。

Figure 7.U2OS細胞において、細胞の生存率は複数の細胞継代を通じて維持されます。生存率はCeligoを使用して測定されました。CDK9は共通の必須遺伝子であるため、継代に伴い生存率と細胞数が低下する現象が観察されます。

XDelテクノロジーは持続的なタンパク質減少をもたらします。

Figure 8.タンパク質の発現低下は、さまざまな遺伝子ノックアウト細胞株において一貫して観察されます。これにより、これらの細胞プールを機能解析に直接かつ信頼性高く使用することが可能です。5つのノックアウト標的遺伝子に対するウェスタンブロット解析では、3つの指定された時間点（7日、14日、21日）において、陰性対照と比較してタンパク質の発現が完全に低下していることが示されました。標的遺伝子に対するノックアウト細胞プールは、U2OS細胞にマルチガイドsgRNAとCas9（RNPとして）をヌクレオフェクションにより導入することで生成されました。各標的に対して、非標的sgRNAを用いた陰性対照プールもトランスフェクションされました。