ノックアウト細胞ライブラリ（マルチガイドデザイン）

高速かつ信頼性の高いスクリーニングを実現するためのすべて

EditCo社のEngineered Cell Libraryは、機能アッセイにおける高スループットCRISPRスクリーニングを簡素化し、インフラの制限やトランスフェクションの課題といった従来の障壁を克服します。これらのカスタムパネルは、高度なマルチガイド技術を用いて設計されたノックアウト不老不死化プールから構成され、90%を超える編集効率を実現し、使用可能な96ウェルアレイ形式で提供されます。効率的なワークフロー、包括的な品質管理レポート、多様なダウンストリームアッセイとの互換性を備えたEditCo社のライブラリは、大規模な薬物標的の発見と検証を自信を持って行うことを可能にし、アッセイに集中できるよう、CRISPRの複雑な部分をEditCo社が対応します。

Engineered Cell Libraryのワークフローには、マルチガイド設計、高スループットトランスフェクション、ノックアウトプール生成、ジェノタイピング、およびシーケンス解析が含まれます。

Engineered Cell Libraryは、多様な細胞タイプにおいて高い編集効率を示します
Engineered Cell Libraryは、機能アッセイに直接使用可能なCRISPR編集済み細胞プールの一式を提供し、多様なスクリーニングや発見アプリケーションに対応可能です。各プールの編集効率は、シーケンス解析とICE解析により評価され、アッセイ結果の解釈に役立てられます。

ヒト不死化細胞株におけるノックアウト

Figure 1. 42の遺伝子標的に対応するノックアウト細胞プールライブラリが、ヒト細胞における高スループット編集により生成されました。実験のデータは上記に示されています。42の遺伝子標的を有するエンジニアード細胞ライブラリは、多ガイド技術を用いて不死化接着性ヒト細胞株A375において高スループット編集により生成されました。データは、インデル頻度とノックアウトスコアの両方を示しています。シーケンシングと解析に成功した84％のプールにおいて、平均インデル頻度99％と平均ノックアウトスコア98％が観察されました。

マウス不老不死細胞株におけるノックアウト

Figure 2. マウス細胞において高スループット編集技術を用いて、192の遺伝子標的に対応するノックアウト細胞プールライブラリが生成されました。データは、インデル頻度とノックアウトスコアの両方を示しています。分析に成功した80％のプールにおいて、平均インデル頻度は89％、平均ノックアウトスコアは84％でした。

EditCo社の独自のガイドデザインは、機能的ノックアウトと持続的なタンパク質減少を実現します

マルチガイドアプローチは、最大3つのgRNA（紫色のバー）を空間的に協調させ、遺伝子の単一の早期エクソンを標的とし、標的配列において複数の同時的な二重鎖切断を引き起こします。これにより、1つまたは複数の>21 bpの断片欠失が生じます。このアプローチは、編集されたプールにおけるノックアウトアレルの頻度が高く、単一ガイドアプローチと比較してオフターゲット編集の発生率が低いという特徴を有しています。

Figure 3. マルチガイドアプローチは、3つのgRNAを空間的に協調させて単一のエクソン内で断片欠失を生成する手法です。遺伝子の早期エクソンを標的とすることで、標的配列において複数の同時的な二重鎖切断を引き起こします。これにより、1つまたは複数の>21 bpの断片欠失が生じます。このアプローチは、編集されたプールにおいてノックアウトアレルの頻度がより高い一方で、シングルガイドアプローチと比較してオフターゲット編集の発生頻度が低下する特徴を有しています。

Figure 4. マルチガイド技術を用いた編集済み細胞プールは、持続的なタンパク質欠損を示します。これにより、これらの細胞プールを機能解析に直接かつ信頼性高く使用することが可能になります。5つのノックアウト標的遺伝子に対するウェスタンブロット解析では、3つの指定された時間点（7日、14日、21日）において、陰性対照と比較してタンパク質が完全に欠損していることが示されました。標的遺伝子に対するノックアウト細胞プールは、U2OS細胞にマルチガイドgRNAとCas9（RNPとして）をヌクレオフェクションにより導入することで生成されました。各標的に対して、非標的gRNAを用いた陰性対照プールもトランスフェクションされました。