Arrayed CRISPR gRNA Libraries（マルチガイドデザイン）

カスタムHiBiTタグ付きノックイン不老不死化細胞およびiPS細胞

高いノックアウト効率 ターゲット部位での編集効率の向上と一貫した機能的ノックアウト性能を実現します。 信頼性の高い品質 独自のXDel技術と堅牢な品質管理により、あらゆるスクリーニングにおいて信頼性を確保します。 信頼性の高いスクリーニング、簡素化 ノックアウトを正確に定量化するだけで、当社の迅速なターンアラウンドタイムにより、より迅速かつ容易にスクリーニングを行うことができます。

他の機能喪失スクリーニングライブラリは、手間のかかる準備、複雑なデータ分析を必要とし、編集効率も低いという欠点があります。また、低品質の試薬は、初代細胞などの敏感な細胞タイプに対して細胞毒性を示す場合もあります。EditCo のアレイ型 CRISPR 合成ガイド RNA ライブラリは、それらとは異なります。

EditCo社の XDel 技術 は、従来の CRISPR ノックアウト戦略の非効率性に対処するために設計されました。あらかじめ設計されたガイド RNA (gRNA) のセットが、遺伝子の単一の初期エクソンを標的とし、協調して働き、標的となる断片の欠失を作成することで編集効率を高めます。ランダムなインデルを導入する標準的な方法とは異なり、EditCo社のアプローチでは、より信頼性の高い遺伝子破壊と完全な機能的ノックアウトを実現するために、協調的な欠失を確実に実施します。

EditCo社のライブラリは、RNP に複合化されているか、Cas9 を発現する細胞株に直接導入されており、長い準備プロトコルを必要とせずに、すぐにトランスフェクションに使用できます。アレイ形式により、NGS のデコンボリューションが不要になり、スクリーニングが簡略化され、バイナリおよび多パラメータの機能アッセイが可能になります。

さらに、XDelの設計により、標準的な PCR 増幅を使用してノックアウト遺伝子フラグメントを迅速に定量化できるため、CRISPR ワークフローにシームレスに統合することができます。当社の ICE ツールを使用した Sanger シーケンシングにより、編集結果を数秒で分析することができます。

Figure 1. EditCo社 アレイ型 gRNA ライブラリ ワークフロー。スマートガイド設計と自動化を組み合わせ、EditCo社の高品質管理を適用することで、各ウェルに最高品質の sgRNA を高精度でプレートします。これにより、スクリーニングにおいてターゲットを確実にノックアウトできることを保証します（必須でない遺伝子を除く）。最適化されたワークフローにより、当社では配列化 CRISPR gRNA ライブラリを最短7日で、類い稀な速さで納品可能です。

Whole Genome
ヒトまたはマウス全ゲノムに対する包括的な遺伝子カバレッジ
EditCo社のXDelテクノロジーを採用した全ヒトゲノムおよび全マウスゲノムライブラリを提供しています。EditCo社の全ゲノムライブラリは、最高レベルの編集効率を実現し、偽陰性を最小限に抑えます。また、20,000を超える遺伝子ターゲットに対して手間のかかる準備を省略できるよう、トランスフェクション可能な状態で提供されます。

ヒト全ゲノムおよびマウス全ゲノムライブラリは、ターゲット同定スクリーニングの最大限の活用を可能にしますが、特定の遺伝子セットや経路の研究に焦点を当てたい場合は、カスタムライブラリまたはパスウェイライブラリをご確認ください。

CRISPRスクリーニング実験を完了するには、SpCas9ヌクレアーゼとTris-EDTAバッファー、またはヌクレアーゼフリーウォーターを使用して、XDel合成ガイドを再水和させてください。

特徴	納品物
種 ・ヒト ・マウス サイズ ・ヒト - 150 pmol から 10 nmol ・マウス - 30 pmol から 150 pmol Plate Format ・Human 96-well plate: 96-well Polypropylene ・Human 384-well plate: 384-well Polypropylene, 384-well Echo-Validated, 384-well Echo-LDV ・Mouse 384-well plate: Nunc or Echo-Validated	・SpCas9 XDelガイドプレートライブラリ（1ウェルあたり最大3ガイド）、乾燥状態 ・修飾合成ガイド（最初の3塩基と最後の3塩基に2『 O-メチルアナログ、最初の3塩基と最後の2塩基の間に3』 フォスフォロチオエート） ・修飾は分解を防止し、細胞内免疫応答の誘発を防ぎます ・ライブラリプレートレイアウト（.csv） ・QC文書（PDF）およびPCRとサンガーシーケンス用のガイドとプライマー配列（.csvファイル） ・ユーザーが選択した追加コントロール

パスウェイライブラリ
EditCo社のパスウェイライブラリでターゲット発見を革新
EditCo社は、ドラッグ可能ターゲット、GPCR、キナーゼ、免疫腫瘍学ターゲットを含む30種類以上のパスウェイライブラリを提供しています。これらのライブラリはターゲット同定研究に最適で、発見プロセスを開始するための包括的な遺伝子セットを提供します。一部のパスウェイライブラリは最短1週間で出荷可能のため、スクリーニングをさらに早く開始できます。EditCo社のパスウェイライブラリは、予測可能なノックアウトを高い効率で実現し、偽陰性を低減するXDel設計を採用しています。以下の表で利用可能なパスウェイライブラリの全リストをご確認ください。より広範なカバー範囲をご希望の場合は、EditCo社の全ゲノムライブラリをご確認ください。特定のターゲットセットをご希望の場合は、カスタムライブラリをライブラリをご確認ください。

CRISPRスクリーニング実験を完了するには、SpCas9ヌクレアーゼとTris-EDTAバッファーまたはNuclease-Free Waterを使用して、XDel合成ガイドを再水和させてください。

取り扱い可能な遺伝子パスウェイ

パスウェイライブラリ　リスト	ライブラリに含まれる遺伝子の数
Apoptosis Pathway Library	1997
Autophagy Library	460
B-Cell Activation Pathway Library	242
Cell Adhesion Genes Library	1479
Cell Cycle Regulators Library	1251
Cell Surface Proteins Library	2738
Complete Druggable Library	8478
Kinase Library	1035
Cytokines and Chemokines Library	310
Cytoskeleton Genes Library	745
Deubiquitinating Enzymes Library	117
DNA Repair Pathway Library	530
Epigenetic Regulators Library	826
Essential Genes Library	2553
Extracellular Matrix Genes Library	363
G-Protein Coupled Receptors Library	1046
Helicases Library	154
Immunology/Immuno-Oncology Library	3098
Ion Channels Library	685
JAK-STAT Pathway Library	194
Metabolic Activity Library	11432
Nuclear Hormone Receptors Library	192
p53 Pathway Library	319
Pattern Recognition Receptors and Signaling Pathways Library	303
Phosphatases Library	344
SARS-CoV-2 Druggable Interactome Library	63
SARS-CoV-2 Interactome Library	324
Secreted Proteins Library	5292
Serine Proteases Library	263
T-Cell Activation Pathway Library	524
Transcription Factors Library	2358
Tumor Suppressors Library	1055
Tyrosine Kinases Library	152
Ubiquitin Ligases Activity (E1, E2, E3) Library	1159
Ubiquitin Protein Ligases Library	336

カスタムライブラリー
ターゲット遺伝子セットを確実にノックアウト
EditCo社のXDel配列ノックアウトライブラリの一環として、ユーザー定義ライブラリも提供しています。これにより、ヒトとマウスゲノムから特定の遺伝子セットを選択でき、ターゲット検証研究に最適です。ヒトユーザー定義ライブラリは最短1週間で出荷可能です。EditCo社のユーザー定義ライブラリはXDel技術を採用し、高効率で予測可能なノックアウトを実現し、偽陰性を低減します。すべてのライブラリはトランスフェクション可能な状態で到着するため、代替ライブラリで必要な手間のかかる工程を省略でき、ヒトやマウス細胞のあらゆる細胞タイプ（一次細胞を含む）でのスクリーニングに利用可能です。

CRISPRスクリーニング実験を完了するには、SpCas9ヌクレアーゼとTris-EDTAバッファー、またはNuclease-free Waterを使用して、XDel合成ガイドを再水和させてください。

特徴	納品物
種 ・ヒト ・マウス サイズ ・ヒト - 150 pmol から 10 nmol ・マウス - 1500 pmol Plate Format ・Human 96-well plate: Nunc Deepwell ・Human 384-well plate: Nunc, ECHO PP, or ECHO LDV ・Mouse 96-well plate: Nunc Deepwell	・SpCas9 XDelガイドプレートライブラリ（1ウェルあたり最大3ガイド）、乾燥状態 ・修飾合成ガイド（最初の3塩基と最後の3塩基に2『 O-メチルアナログ、最初の3塩基と最後の2塩基の間に3』 フォスフォロチオエート） ・修飾は分解を防止し、細胞内免疫応答の誘発を防ぎます ・ライブラリプレートレイアウト（.csv） ・QC文書（PDF）およびPCRとサンガーシーケンス用のガイドとプライマー配列（.csvファイル） ・ユーザーが選択した追加コントロール

ハイスループットのための最適なノックアウト効率
XDel 戦略はどのように機能するのでしょうか？
従来の CRISPR ノックアウト手法は、多くの場合、SpCas9 と連携して、ターゲットの切断部位にさまざまな挿入または欠失（インデル）を生成する単一のガイド RNA に依存しています。このアプローチは予測不可能な場合があり、編集結果にばらつきが生じ、ノックアウトが不完全になることがあります。

EditCo のスマートな情報科学により、1 つの対象遺伝子に最大 3 つの sgRNA をターゲットとするマルチガイド設計が生成されます。ガイドは空間的に調整され、協調してガイド付き修復を誘発し、初期エクソンで断片の欠失をもたらします。これにより、他のプール戦略と比較して最も信頼性の高いノックアウト戦略となっています。

Figure 2.XDel設計には、単一の標的遺伝子に作用する最大3つの改変sgRNA（灰色バー）が含まれます。共トランスフェクションされた場合、これらのsgRNAは標的ゲノム領域で同時に二重鎖切断を引き起こし、その結果、1つまたは複数の21塩基対以上の断片欠失を誘導します。

XDelテクノロジーは一貫して断片欠失を誘導します

Figure 3. XDel 複数の gRNA は断片欠失を引き起こします。個々の gRNA と XDel gRNA の編集効果は、樹状細胞（ヌクレオフェクションにより転送された）における 2 つの遺伝子標的（TNF、TLR4）で比較されました。編集効率は、MiSeqで標的部位のシーケンシングにより分析され、編集タイプ（indelなし、50bp以上の大規模欠失、50bp未満の小規模欠失、挿入）に基づいてシーケンシング結果が分類されました。データは、Dr. Marco Jost and Dr. Jonathan Weissman, University of California, San Francisco, and Dr. Amy Jacobson and Dr. Michael Fischbach, Stanford Universityによって生成されました。

XDelは、不老不死化細胞、iPS細胞、および一次細胞において、シングルガイドと比較してより高い一貫性のあるオンターゲット編集を実現します。

Figure 4. XDelの複数gRNAによるオンターゲット編集効率は、単一ガイドRNA法と比較して著しく高く、かつ一貫性があります。7つの内在性標的遺伝子座（既知の高オフターゲット編集部位を有する）において、2つの不死化細胞株（IMM）と2つのiPSC細胞株にトランスフェクションを行った結果、マルチガイド（ピンクのバー）とそれぞれの3つの単一ガイドRNA（ブルーのバー）のオンターゲット編集効率を比較すると、XDel技術は単一ガイドRNA手法に比べて著しく高く、かつ一貫性のあるオンターゲット編集効率を実現しています。各トランスフェクションは3回繰り返し実施され、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel技術は、単一ガイド編集と比較してオンターゲット遺伝子編集を最大化し、オフターゲット効果を最小化します

Figure 5.XDelの複数ガイドRNA編集効率は、単一ガイドRNA法と比較してgRNA濃度を低下させても高いまま維持されます。転染されたHEK293細胞における複数ガイド（左）と単一ガイド（右）およびSpCas9を用いたRNP濃度（0.25X、 1X、4X）における7つの内在性サイトでのオンターゲット編集効率と、63のオフターゲットサイトでのオフターゲット編集効率（積み重ねた灰色バー）を比較すると、XDel細胞はシングルガイドと比較して、オフターゲット効果を最小限に抑えながら高いオンターゲット編集効率を維持することが示されています。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel技術を用いた編集細胞は、複数の細胞継代にわたって持続的な遺伝子ノックアウトを示します。

Figure 6. XDelの複数ガイドRNA編集効率は、単一ガイドRNA法と比較してgRNA濃度を低下させても高いまま維持されます。転染されたHEK293細胞における複数ガイド（左）と単一ガイド（右）およびSpCas9を用いたRNP濃度（0.25X、 1X、4X）における7つの内在性サイトでのオンターゲット編集効率と、63のオフターゲットサイトでのオフターゲット編集効率（積み重ねた灰色バー）を比較すると、XDel細胞はシングルガイドと比較して、オフターゲット効果を最小限に抑えながら高いオンターゲット編集効率を維持することが示されています。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel技術を用いた編集細胞は、複数の細胞継代にわたって持続的な遺伝子ノックアウトを示します。

Figure 7. XDelの複数ガイドRNA編集効率は、単一ガイドRNA法と比較してgRNA濃度を低下させても高いまま維持されます。転染されたHEK293細胞における複数ガイド（左）と単一ガイド（右）およびSpCas9を用いたRNP濃度（0.25X、 1X、4X）における7つの内在性サイトでのオンターゲット編集効率と、63のオフターゲットサイトでのオフターゲット編集効率（積み重ねた灰色バー）を比較すると、XDel細胞はシングルガイドと比較して、オフターゲット効果を最小限に抑えながら高いオンターゲット編集効率を維持することが示されています。各トランスフェクションは3回繰り返し行われ、データはEditCoの独自ソフトウェア解析によりNGSで解析されました。

XDel技術を用いた編集細胞は、複数の細胞継代にわたって持続的な遺伝子ノックアウトを示します

Figure 8. U2OS細胞において、細胞の生存率は複数の細胞継代を通じて維持されます。生存率はCeligoを使用して測定されました。CDK9は共通の必須遺伝子であるため、継代に伴い生存率と細胞数が低下する現象が観察されます。

XDelテクノロジーは持続的なタンパク質減少をもたらします。

Figure 9. タンパク質の発現低下は、さまざまな遺伝子ノックアウト細胞株において一貫して観察されます。これにより、これらの細胞プールを機能解析に直接かつ信頼性高く使用することが可能です。5つのノックアウト標的遺伝子に対するウェスタンブロット解析では、3つの指定された時間点（7日、14日、21日）において、陰性対照と比較してタンパク質の発現が完全に低下していることが示されました。標的遺伝子に対するノックアウト細胞プールは、U2OS細胞にマルチガイドsgRNAとCas9（RNPとして）をヌクレオフェクションにより導入することで生成されました。各標的に対して、非標的sgRNAを用いた陰性対照プールもトランスフェクションされました。

Figure 10. 77の遺伝子において、配列化されたXDelライブラリは平均75%のノックアウトスコアを示しました。EditCo社のマルチガイドアルゴリズムを使用し、86の遺伝子を対象に、1つの標的あたり最大3つの改変gRNAを、ヌクレオフェクション法を用いてU2OS-Cas9発現細胞株に導入しました。これにより、77の遺伝子において平均75%のノックアウトスコアが得られました。86遺伝子中9遺伝子はシーケンスエラーにより失敗しました。

EditCoライブラリは、大規模な一次細胞スクリーニングにおいて高い編集効率を実現します。

Figure 11. 97%の中央値編集効率を、一次樹状細胞の280の遺伝子座において確認しました。XDel gRNAは、一次樹状細胞にヌクレオフェクション法を用いて導入されました。編集効率は、280の遺伝子座においてNGSにより評価されました。Data courtesy of Weissman Lab, UCSF.