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DuraScribe® T7 Transcription Kit
DuraScribe® T7 Transcription Kitで合成されたは2'-Fluorine修飾RNA転写産物をDuraScript RNA転写産物と呼びます。これは完全にRNase A耐性で1 DuraScript RNAは保存期間および関連する全てのRNAアプリケーション中非常に安定で、転写RNAをインタクトに保つための煩雑な操作や時間のかかる処理なども必要ありません。近年の研究では2本鎖DuraScript RNAを血清を含む哺乳類培養細胞中にtransfection試薬なしで導入できることが示されました。2 promoterをもつ2本鎖オリゴヌクレオチド、直鎖プラスミド、PCR産物はDuraScribe transcription反応で転写可能です。
キットに含まれるDuraScribecribe® T7 RNA PolymeraseはATPおよびGTPと同様に2'-Fluorine-CTP (2'-F-CTP)と'-Fluorine-UTP (2'-F-UTP)をfull length転写産物に取り込むT7 RNA Polymeraseです。 (Figure 1)
スタンダード20μl DuraScribe反応中、1 μgのDNAテンプレートを使用した場合、およそ50 μgのDuraScript RNAを合成します。DuraScribe T7 RNA PolymeraseはスタンダードT7 RNA Polymeraseと同様にT7 transcription promoterを認識します。
Figure 1.DuraScribe® T7 RNA Polymerases efficiently incorporate 2'-F-dCTP and 2'-F-dUTP into full length DuraScript® RNA.
2’-F-dCと2’-F-dUの2’位置のフッ素はRNase Aよる消化を防ぎます。Durascripts® RNAはRNase Aやリボヌクレア-ゼに対して完全に耐性です。
2'-F-Cと2-F-Uヌクレオチドの存在はDuraScript RNAを遍在するRNase Aに対して完全に耐性にさせます。 (Figure 2). DuraScript RNAはRNase T1およびRNase H対しては感受性があります。DuraScript RNAは、DNase I degradationに対して耐性ですので、転写反応が完了した後DNAテンプレートを除くためにDuraScribe反応液を処理することができます。2本鎖DuraScript RNAはRNase IIIで消化可能です。
Figure 2. DuraScript™ RNAはRNase A消化に耐性です。
1.4 kbのスタンダードRNA転写産物および1.4 kb DuraScribe転写産物をそれぞれ高純度RNase Aで3分間インキュベートしました。スタンダードRNA転写産物は完全にデグラデーションし、DuraScribe RNA転写産物はインタクトのままでした。M, Size ladder; Lane 1, 1.4-kbスタンダードRNA転写産物; Lane 2, RNase A処理後のスタンダードRNA; Lane 3, 1.4-kb DuraScript RNA; Lane 4, RNase A処理後のDuraScript RNA
Figure 3. DuraScript™ RNAは組織培養液中で2時間安定です。
5μgの1.4-kb スタンダード RNA 転写産物およびDuraScript RNAを組織培養液（D-MEM + 10% fetal calf serum）37℃でインキュベートしました。 Lane 1, RNA ladder; Lane 2, スタンダードRNA; Lane 3, 組織培養液中で15分間おいたRNA; Lane 4, DuraScript RNA; Lanes 5-8 組織培養液中でそれぞれ15、30、60、120分間おいたDuraScribe RNA
Applications
- In situ hybridization
- Ribonuclease protection assays
- RNA interference (RNAi)2
- Ribozyme and aptamer studies
- Anti-Sense RNA
Applications
- DuraScript RNA is completely resistant to RNase A and to the nucleases found on human skin.
- Double-stranded DuraScript RNA is taken up by cultured mammalian cells in the presence of serum and without the need for transfection reagents.2
- DuraScript RNA has improved stability in storage and most applications.
- DuraScript RNA can be digested by RNase T1 and RNase H, and double-stranded DuraScript RNA can be digested by RNase III.
- DuraScribe T7 RNA Polymerases utilize the same transcription promoters as standard T7 RNA Polymerases.
- No need for gloves, DEPC-treatment of reagents, or RNase Inhibitors when making or working with DuraScript RNA.
- A standard DuraScribe reaction produces 50 μg of DuraScript RNA.
- Fluorescently-labeled DuraScribe RNA can be readily produced.
Figure 5. Forty to sixty μg of a 1.4-kb DuraScript® RNA is produced in a standard 4-hour DuraScribe® T7 Transcription reaction.
Figure 6. A DuraScribe® reaction can be scaled-up to produce even more DuraScript® RNA.
Shown is scale up of a DuraScribe T7 Transcription reaction.
References
- Meis, J.E. and Chen, F. (2002) EPICENTRE Forum 9 (1), 10.
- Capodici, J. et al. (2002) J. Immunol. 169, 5196.
*The use of DuraScribe Transcription Kits to synthesize nucleic acids with non-canonical bases or for partial ribosubstitution is covered by U.S. patents 5,849,546; 6,107,037 and other patents issued or pending. These products are accompanied by a limited non-exclusive license for the purchaser to use the purchased product(s) solely for life science research. Contact EPICENTRE concerning licenses for other uses.
† Note: EPICENTRE products are licensed under U.S. and international patent rights owned by the Carnegie Institution of Washington that cover RNA interference. These products are accompanied by a limited non-exclusive worldwide license under the Carnegie Institution of Washington’s patent rights for researchers at academic or other not-for-profit institutions to use the product for non-profit research. However, use of dsRNA for RNA interference by for-profit organizations requires a license from the Carnegie Institution of Washington. For-profit institutions should contact Gloria Brienza of the Carnegie Institution of Washington, 1530 P Street, N.W., Washington, D.C. 20005-1910. E-mail: gbrienza@pst.ciw.edu.