CopyCutter™ EPI400™ Electrocompetent E. coli
CopyCutter™ EPI400™ Chemically Competent E. coli

不安定なDNA配列、毒性タンパク質を発現する遺伝子のクローニングに

CopyCutter™ EPI400™ E. coli^* cellは 、幅広い一般的なベクターのコピー数を大幅に低くすることができ、不安定なDNA配列でも容易にクローニングできます。細胞成長を阻害するタンパク質をコードするDNAやAT-richやGC-richを含む 配列、強く２次構造を持つ配列は度々、多コピーでは不安定になります。 (Fig. 2)¹

CopyCutter EPI400は、Epicentre社の高形質転換効率を持つphage T1-resistant TransforMAX™ EC100™-T1^R E.coli からColE1やpMB1複製起点(e.g., pUC- and pET-type vectors)を持つベクターのコピー数を制御する遺伝子を操作することによって作製されました。TransforMAX EC100strainから構成的に発現している pcnB (plasmid copy number)を取り除き、誘導できるプロモーターにリンクした修飾した pcnB 遺伝子に置き換えられています。

ColE1タイプのベクターをopyCutter EPI400 strainとTransforMAX EC100 strainで比べた場合、コピー数は約4-25倍低くなります。さらにCopyCutter Induction Solutionの存在下で短い期間インキュベーションすることでベクターのコピー数を上げられ、プラスミドDNAの収量を改善することができます。(Fig. 3)

Figure 1. ColE1タイプのプラスミドのコピー数は、CopyCutter™ EPI400™ E. coli cellでは25倍低くなります。

Lanes C, TransforMax™ EC100™ cells; Lanes U, 誘導していないCopyCutter EPI400 cell ;　Lanes I,　誘導しているCopyCutter EPI400 cells

OD₆₀₀を測定して同じ数の溶解した細胞から抽出したDNAをレーンごとにロードしました。

Figure 2. CopyCutter™ EPI400™ E. coli cellを使用することで毒性遺伝子産物をエンコードするDNAを高コピーベクターにクローニングすることができます。

シーケンスの結果、TransforMAX™ EC100™ cell中のfull-length acpP クローンは、複数の点変異が見つかりました。

Figure 3. CopyCutter Induction Solutionを使用するこで regB クローンを高コピーに誘導できます。

選択培地で生育した細胞から調製されたプラスミドDNAの粗抽出物は、アガロース電気泳動にて解析されました。OD600を測定して同じ数の溶解した細胞から抽出したDNAをレーンごとにロードしました。

U: uninduced

I: induced

利　点

• 低コピー数にクローンを維持し、プラスミド収量を改善するために高コピー数に誘導できます。
• 高い形質転換効率
• バクテリオファージT1とT5に耐性を持つtonA 遺伝子
• 組換え体のblue/whiteスクリーニングにはlacZΔM15 を使用しています
• 制限マイナス (mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)) がメチル化DNAのクローニングも可能にします
• エンドヌクレア-ゼ マイナス (endA1) がDNAを効率よく産出します
• 組換えマイナス (recA1) が大きなクローンインサートを安定化して保持します

Geneotype

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG tonA pcnB4 dhfr

CopyCutter EPI400 Electrocompetent E. coli

形質転換効率： >1 x 10¹⁰ cfu/μg of pUC19.

CopyCutter EPI400 Chemically Competent E. coli

形質転換効率： >1 x 10⁷ cfu/μg of pUC19.

Reference

1. Haskins, D. (2004) Epicentre Forum 11(5), 6.

*Covered by issued and/or pending patents.

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