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Watchmaker DNA Library Prep Kit with TAPS+
新規のメチル化シークエンシング手法であるTAPS（TET-assisted pyridine borane sequencing）は、酵素変換によりメチル化シトシン（5mCおよび5hmC）を変換しチミンとして読み取る新しいメチル化解析手法です。従来のバイサルファイトシーケンシングと比較して、テンプレートへのダメージとノイズを大幅に低減しながら、直接的かつ高忠実度のメチル化マッピングを可能にします。
特徴と利点
- 直接的な5mCリードアウトにより、同一ライブラリーから遺伝子変異（SNV/インデルおよびCNV）とエピジェネティック修飾の同時検出が可能
- 98%を超える5mC変換率（低メチル化領域と高メチル化領域の両方を含む）により、高い真陽性率と低い偽陽性率を実現
- サンプルにダメージを与えないワークフローにより、劣化FFPEやcfDNAを含む少量サンプル（1 ngまで）でも堅牢なパフォーマンスを実現
- 合理化され自動化に適したワークフローにより、カラム不要で6時間でライブラリーを生成
- 配列多様性の向上によりマッピング性が向上し、マルチマッピング/低複雑性ドロップアウトが低減し、特定のリード深度におけるCpGカバレッジが向上します
- 解析時間を30%以上短縮し、30Xゲノムシーケンスにおける時間と関連コストを節約します
アプリケーション
- 全ゲノムまたは標的メチル化シーケンシング
- リキッドバイオプシー（cfDNA/ctDNA）研究
- メチル化とゲノムバリアントの同時検出
- フラグメントミクス
- メチル化差異解析
- エピゲノムワイド関連研究（EWAS）
- アレル特異的メチル化解析
- FFPEを含む腫瘍プロファイリング
- バイオマーカー探索
1日で完了するオートメーションにも適したライブラリー調製
図1. 自動化可能なワークフローで所要時間を短縮。Watchmaker DNA Library Prep Kit with TAPS+は、6時間以内にライブラリーを作成し、自動化されたリキッドハンドラーにスムーズに移行可能なワークフローでハイスループット処理を実現します。この方法では、特殊な消耗品（バイサルファイトワークフローでよく使用される変換カラムなど）は必要ありません。
陽性メチル化の読み取りは配列の複雑さを維持します
TAPS+は本来の配列の多様性を維持するポジティブメチル化リードアウトを提供し、従来のメチル化シーケンス法に固有の複雑性の低下を克服します。ゲノムの4塩基構成を維持し、5mCを5番目の塩基として区別することで、TAPS+はアライメント品質を向上させ、計算時間を短縮し、ゲノムバリアントの検出を可能にします。
図2. 5塩基ゲノムのシーケンス。ヒトゲノム中のCpG領域に含まれるシトシンは全体の約1〜2%に過ぎず、メチル化の大部分はCpG領域で起きています。TAPS+は、メチル化されたCpGシトシンのみを変換し、残りの約20%のシトシンはそのまま残します。その結果、ネイティブの4塩基の複雑さを維持し、ヒトゲノムとの整合性を高め、さらに5mC（5番目の塩基）の検出も可能なライブラリが得られます。
単一のライブラリからマルチモーダルな洞察を引き出します
TAPS+は、高効率の5mC変換と最小限の偽陽性により、正確なメチル化プロファイリングを実現します。塩基の複雑性を維持することで、全ゲノムシーケンスコントロールとほぼ一致するSNV F1スコアとCNVプロファイルによって実証されるように、高感度かつ高精度なゲノムバリアント検出も可能にします。
図3. メチル化プロファイリングとゲノムバリアントの同時検出。図1に示したワークフローを用いて、未変換コントロール（Watchmaker DNA Library Prep Kit）とともに2重にライブラリーを調製した。(A) 完全メチル化ラムダDNAを用いて測定したポジティブコントロールCpGメチル化率。(B) NA12878におけるCHHメチル化測定に基づく偽陽性率。(C) SNV検出のためのF1スコア。ライブラリーは同等のリードにサブサンプリングされた。未変換コントロールおよびTAPS+ライブラリーにはTAPS+ Variant Callerを使用し、EM-Seq v2およびBS-SeqライブラリーにはBS-SNPerを使用した。(D) 35 ngの乳がん全核酸から調製したTAPS+および未変換コントロールライブラリーのCNV解析。
cfDNAからの高感度メチル化およびフラグメントミクス解析
リキッドバイオプシーアッセイにおけるメチル化情報は、高感度な癌検出、分類、残存病変モニタリングを可能にします。
TAPS+はcfDNA断片を保存し、高いCpGカバレッジで高解像度のメチル化プロファイルとフラグメントミクスプロファイルを提供します。
図4. 非損傷ワークフローはcfDNA断片を保護し、高いCpGカバレッジを実現します。図1に示したワークフローを用いて、非変換コントロール（Watchmaker DNA Library Prep Kit）とともに、2重にライブラリーを調製しました。(A) インサート長によるリード分布、および (B) CpGアイランドにおけるCpGの累積カバレッジ。
FFPEサンプルからのデータ品質とカバレッジの向上
TAPS+は、困難なFFPE検体からDNAの完全性を維持し、単一ライブラリーからのメチル化解析とバリアント解析を同時に可能にします。穏やかな化学反応によりCpGカバレッジが向上し、偽陽性とシーケンスアーティファクトが低減されるため、腫瘍情報に基づいた研究やアーカイブ研究の精度が向上し、劣化した臨床的に重要な検体の有用性が高まります。
図5. FFPEによるメチル化およびゲノムバリアントコールの信頼性向上。FFPE由来DNA10 ngから2重にライブラリーを調製した。(A) CpGアイランドにおけるCpGの累積カバレッジ。(B) CHHメチル化測定による偽陽性率。(C) Picard法による重複、キメラリード、および不適切なペアの割合。(D) 100万リードあたりのヘアピン配列アーティファクト。