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アプリケーションノート
DuraScribe T7 Transcription Kit
DuraScribe T7 Transcription Kitは、DNAから安定化した（分解されにくい）RNAを作製することができます。 2’-Fluorine-CTPと2’-Fluorine-UTPを転写産物に取り込ませるRNA合成酵素であり、2’-フッ化修飾RNA転写産物を合成することができます。
RNAは2’位のヒドロキシ基のために不安定だと考えられていますが、DuraScribeにより合成されたRNAはシトシンとウラシル2’位にフッ素が存在し、合成されたRNAはDuraScript RNAと呼び、RNaseAに耐性を持つことになります。
実際にDuraScript RNAは、以下の実験でも安定していることが証明されています。
- RNAをRNase Aで処理
1.4 kbのスタンダードRNAおよび1.4 kb DuraScribeをそれぞれ高純度RNase Aで3分間インキュベート。 スタンダードRNA転写産物は完全に分解されたのに対し、DuraScribe RNA転写産物は分解されていない。
- 培地+血清中にRNAを添加
5μgの1.4-kb スタンダードRNA 転写産物および、DuraScribe RNAを培養液（DMEM + 10% FCS）に加え、37℃でインキュベート。 スタンダードRNAは15分で分解したのに対し、DuraScribe RNAは120分後でも安定。
- ヌクレアーゼがコンタミしたDWを使用
1.4 kbのスタンダードRNAおよび1.4 kb DuraScribeを、水とコンタミした水（指のヌクレアーゼ）を使用して転写。 DuraScribe RNAは指ヌクレアーゼがコンタミした水を使用しても安定。
1本鎖のみ必要な場合には、RNase�靴砲茲辰�2本鎖RNAを分解することも可能となっています。 さらなる特徴としては1μgのDNAテンプレートを使用した場合、およそ50μgのDuraScript RNAを合成することが可能です。
高効率で合成され、コスト的にも効率よく作られる2’-Fluorine -modified RNAは、
- In situハイブリダイゼーション
- RNaseプロテクションアッセイ
- リボザイム研究
- アンチセンスRNA研究
- さらにはRNA アプタマー合成に用いられています。
DuraScribeは、ヌクレアーゼ耐性RNAの大量合成を可能としSELEX法を用いたスクリーニング段階で利用されている製品です。
ここで少しSELEX法についてふれてみたいと思います。
特異的に分子を認識するRNAアプタマーのスクリーニング法として、SELEX （Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)）法と呼ばれる試験管内での試験法が知られています。SELEX法は1990年にL.Goldらに報告されており、ランダムな配列を持つ核酸ライブラリーを調整、選別したうえでPCR法により増幅し、ターゲットとの結合強度の高いものだけを濃縮する方法です。
現在SELEX法の自動化が進んでおり効率よくアプタマーを見出すことが可能です。しかしながらRNAは直ぐに分解されてしまうため、in vitroでのスクリーニング段階からヌクレアーゼ耐性RNAアプタマーが必要とされています。
このような場面で、DuraScribe は活躍しており、DNAから安定化したRNAを作製できます。
実際にEpicentre社がDuraScribeを用いてRNAアプタマーを合成したのが次の論文です。
Produce High Yields of a High Affinity 2’-F-RNA Aptamer Using the DuraScribe® T7 Transcription Kit
内容 ↓
Tahiri-Alaoui A らによってstreptavidin（ストレプトアビジン）のアプタマー合成を参考にDuraScribe T7 Transcription Kitを用いてstreptavidinのRNAアプタマー合成を行いました。
アプタマーの配列は、
5’-CAT GTC GAA CCG TCA ACG TTC GTA TTA CGC ATA GAG GTC GCA TGT GCG CTA GGA AAG TTG AGC GTC TAG TCT TGT CTC CCT ATA GTG A-3’
で、streptavidinドメイン�機↓兇鯒Ъ韻垢襦�wildタイプ）と、同時に上記の赤字AをGに変換したnon-bindingなRNAアプタマーも合成しました（mutantタイプ）。
DuraScribeによりwildタイプのRNAアプタマーは1μgのテンプレートから12.9μg、mutantタイプのRNAアプタマーは1μgのテンプレートから15.9μg合成可能でした。
DuraScribe T7 Transcriptionを使用してアプタマーを合成
- Lane 1：DuraScript streptavidin RNAアプタマー（wildタイプ）
- Lane 2：DuraScript RNAアプタマー（mutantタイプ）
- Lane M：10bp DNA ladder
RNAアプタマー（wildタイプ）は、streptavidinの添加濃度依存的に結合し、1塩基のみ置換したmutantタイプのRNAアプタマーにはstreptavidinは結合しませんでした。また過度のラベルしていないアプタマーを加えることで、選択特異性を確かめ、これらの結果より、DuraScribe T7 によって合成されたRNAアプタマーは、特異性が高いことがわかります。
- Lane1：wildタイプアプタマー+ 20nM streptavidin
- Lane2：free-mutantタイプアプタマー
- Lane3：mutantタイプアプタマー + 20nM streptavidin
- Lane4：wildタイプアプタマー+ 20nM streptavidin
- Lane5：wildタイプアプタマー+ 20nM streptavidin + ラベルなしwildタイプアプタマー
RNAアプタマーのヌクレアーゼ耐性への問題は重要な課題であり、実用化にも大きく関ってきます。 ヌクレアーゼ耐性を持ち、かつ大量合成できるRNA合成技術は魅力的であり今後のアプタマー研究に不可欠なものとなり、DuraScribeにより安定したRNAアプタマーを合成しSELEX法によるスクリーニングは非常に有効な手段となっています。