TargetAmp™ aRNA Amplification Kits

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• Process
• Performance
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• Citations

The TargetAmp™ RNA Amplification Process

TargetAmp 1- & 2-Round Amplification Kitsは、改良型の"Eberwine" 直鎖RNA増幅法を採用しています。この"Eberwine" RNA増幅法は、James Eberwine 氏(RN Van Gelder et. al., 1990, PNAS USA 87:1663)によって開発された手法で、最もRNA再現性のある結果が出る手法として広く認識されています。

• 改良型berwine RNA増幅手順
• TargetAmp 1-Round & 2-Round RNA増幅工程の概要
• TargetAmp 1-Round & 2-Round反応に掛かる時間

TargetAmp RNA Amplification Kitsは改良型Eberwine RNA増幅工程を採用

• TargetAmp 1-Round amplificationは6時間で反応を終了します。
• TargetAmp 2-Round amplificationは2日で反応を終了します。
• 1st-strand及び2nd-strand cDNA synthesis反応は、高温で行うので、完全長cDNAを合成できる可能性を高くします。
• in vitro transcription反応の際にcDNAを精製する必要はありません。
• TargetAmp Kitsは、aRNAもしくはアミノアリルRNAを高収量で合成できるEPICENTRE社のAmpliScribe™ technologyを採用しています。
• TargetAmp Kitsは、SuperScript™ II and SuperScript™ III Reverse Transcriptase（Invitrogen社）用に最適化しています。
• 試薬を混合させているのでピペッティング操作を最小限にできます。

TargetAmp™ 1-Round & 2-Round RNA増幅工程の概要

1. First-strand cDNA Synthesis.
   Poly(A) RNAtotal RNAサンプル中のpoly(A) RNAは、1st strand cDNAへ逆転写されます。この反応に使用されるオリゴ(dT)は、phge T7 RNA Polymeraseプロモーター配列を5’末端に含んでいます。 1st　strand cDNA合成はSuperScript™ III Reverse Transcriptase (provided by the user)により行われます。
2. Second-strand cDNA Synthesis.
   ステップ1で作製されたcDNA:RNAハイブリッドのRNAは、RNase Hにより小さなフラグメントに分解され、次に2nd strand cDNA合成が行われます。T7プロモーターを含む2本鎖cDNA は、アンチセンスRNA(aRNA,cRNA)をin vitro transcription反応中に合成することが可能となます。合成されたcDNAは、精製することなしにin vitro transcription反応へ使用することができます。
3. aRNA(Aminoallyl-aRNA)の In Vitro Transcription
   ステップ 2で得られた2本鎖cDNAから、迅速なin vitro transcription反応により高収量のaRNA (or aminoallyl-aRNA)が合成されます。
4. aRNA (aminoallyl-aRNA)の精製
   ステップ3で合成されたaRNA (aminoallyl-aRNA) はスピンカラムを用いて精製されます。 (supplied by the user).
   TargetAmp 1-round増幅工程は、終了です。 TargetAmp 2-round増幅工程は、ステップ5-8へ進みます。
5. Round Two, 1st-Strand cDNA合成
   1-Roundにて合成・精製されたaRNAはSuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen社; supplied by the user)を使用して1st strand cDNAを合成します。この反応にはランダム配列の壁サマープライマーを使用します。
6. Round Two, 2nd-Strand cDNA合成
   ステップ1で作製されたcDNA:RNAハイブリッドのRNAは、RNase Hにより小さなフラグメントに分解されます。 Second-strand cDNA合成はT7-Oligo(dT) プライマーを用いて行います。T7プロモーターを含む2本鎖cDNA は、アンチセンスRNA(aRNA,cRNA)をin vitro transcription反応中に合成することが可能となます。
7. aRNA (AminoallylaRNA)のIn Vitro Transcription
   ステップ6で得られた2本鎖cDNAから、迅速なin vitro transcription反応により高収量のaRNA (or aminoallyl-aRNA)が合成されます。
8. aRNA (aminoallyl-aRNA)の精製
   ステップ7で合成されたaRNA (aminoallyl-aRNA) はスピンカラムを用いて精製されます。 (supplied by the user)
   TargetAmp 2-Round 増幅工程は終了です。

TargetAmp 1-Round RNA増幅反応は6時間で終了
TargetAmp 2-Round RNA増幅反応は2日間で終了

• MessageBOOSTER™ cDNA Synthesis kit for qPCR
• ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit