TargetAmp™ aRNA Amplification Kits
TargetAmp™ Kit Performance
- aRNA、Aminoallyl-aRNA、biotin-aRNAの収量と増幅倍率
- 作製されたaRNAのサイズ
- 増幅反応の再現性Reproducibility of the Amplification Reaction
- 遺伝子発現レベルの保存 (Preservation of Relative Abundance of Transcripts)
- Correlation of Differential Gene Expression (Fidelity of Amplification)
- Quality Assessment on GeneChip® Arrays (3' to 5' Ratios and % Present Calls)
aRNA、アミノアリルRNA、Biotin-RNAの収量と増幅倍率
TargetAmp™ aRNA Amplification KitはSuperScript II及びSuperScript III Reverse Transcriptase用に最適化されており、またRNAを高収量で合成できるEPICENTRE社のAmpliScribe™ technologyを採用しています。加えて非特異増幅産物が生じないようにキットを最適化しています。そのためTargetAmp™ RNA Amplification kitは高収量のaRNA（アミノアリルRNA、biotin-RNA）を得ることができます。
Table.1 TargetAmp™ 1-Round aRNA Amplification Kit 103を使用して得たaRNA収量。
結果はキット中のHeLa Total RNAコントロールを使用して数回実験した平均値。TargetAmp 1-Round Amplification Kit 101で得られるアミノアリルaRNA及びTargetAmp 1-Round Biotin-aRNA Amplification Kit 105で得られるBiotin-aRNAの収量は基本的に同じです。
| HeLa Total RNA | HeLa Poly (A) RNA（約2%のHeLa Total RNAがPoly (A) RNAと想定） | aRNA収量 | 増幅倍数（AA-aRNA収量/Poly（A）量） |
| 25 ng | 0.5 ng | 2.9 μg | 5800 |
| 50 ng | 1.0 ng | 5.2 μg | 5200 |
| 100 ng | 2 ng | 11.4 μg | 5700 |
| 200 ng | 4 ng | 22.6 μg | 5650 |
| 400 ng | 8 ng | 45.1 μg | 5640 |
| 500 ng | 10 ng | 69.9 μg | 6990 |
Table.2 TargetAmp™ 2-Round aRNA Amplification Kit 2.0を使用して得られたaRNA収量
結果は、様々なサンプルのTotal RNAを使用して数回実験した平均値です。括弧は、増幅倍数を示しています。1μg以下の非特異的増幅産物が"no-RNA"コントロール反応として検出されました。TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit1.0で得られるアミノアリルaRNAの収量は基本的に同じです。
| Total RNA量 | aRNAの収量 | ||
| From Total Rat Brain RNA （約5%のtotal rat brain RNAがPoly(A)RNAと想定） |
From Total HeLa RNA （約2%のtotal Hela RNAがPoly(A)RNAと想定） |
from Total Rat Kidney RNA （約1.5%-2%のtotal rat kidney RNAがPoly(A)と想定） |
|
| 10 pg (1 cell) | 3 μg (6 x 106) | 1.9 μg (9.5 x 106) | 1.4 μg (9.3 x 106) |
| 50 pg (5 cells) | 21 μg (8.4 x 106) | 9 μg (9 x 106) | 7 μg (9.3 x 106) |
| 100 pg (10 cells) | 54 μg (10.8 x 106) | 19 μg (9.5 x 106) | 17 μg (11 x 106) |
| 200 pg (20 cells) | 75 μg (7.5 x 106) | 37 μg (9.2 x 106) | 33 μg (11 x 106) |
| 500 pg (50 cells) | 143 μg (5.7 x 106) | 74 μg (7.4 x 106) | 71 μg (9.4 x 106) |
作製されたaRNAのサイズ
TargetAmp 1-Round Aminoallyl-aRNA Kit 101, the TargetAmp 1-Round aRNA Amplification Kit 103, and the TargetAmp™ 1-Round Biotin-aRNA Amplification Kit 105は、平均1200basesの長さのアミノアリルaRNA、非標識のaRNA、biotin-aRNAをそれぞれ作製します。（変性アガロースゲル電気泳動及びAgilent社 2100 Bioanalyzerで解析）
TargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Kit 1.0で作製されたアミノアリルaRNAのサイズは、2つの異なる量のTotal RNAを用いて調べました。レーザーキャプチャーされたrat dorsal root ganglion cell (約10 pg) と 200 pg のrat brain total RNAはTargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0を用いて増幅されました。rat dorsal root ganglion cellから作製されたアミノアリルaRNAサイズの分布は、変性アガロースゲル電気泳動(Figure 1a)で、rat brain cells から作製されたアミノアリルaRNAはAgilent 社2100 Bioanalyzer (Figure 1b)にて解析しました。両者とも作製されたアミノアリルaRNAの平均サイズは600 base以上です。
A
B
Figure 1. The TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0 produces AA-aRNA with a size distribution between 200 to 4000 bases.
A. Denaturing agarose gel analysis of AA-aRNA produced from 2 independent single-cell RNA amplification reactions.
B. Agilent 2100 Bioanalyzer analysis of AA-aRNA produced from 200 pg of rat brain total RNA.
増幅反応の再現性
TargetAmp™は1細胞から抽出したTotal RNAからでも一貫した、再現性のある増幅結果をもたらします。
Figure.2 2つのサンプル細胞Total RNA （それぞれRat Brain 背面神経節から採取した1つのLCMキャプチャーセル）がTargetAmp™ 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0を使用して別々に増幅しました。
結果のアミノアリル-aRNAはCy3-NHSで標識されRatアレイにハイブリダイズしました。2つのアレイの相関蛍光強度の点在する座標は増幅過程の再現性をデモンストレーションする為に作成しました。一致係数は0.9932でした。
遺伝子発現レベルの保存 (Preseｒvation of Relative Abundance of Transcripts)
Universal Human Reference RNA (Stratagene)とadult skeletal muscle total RNAにおける相関発現量を、TargetAmp 1-Round及びTargetAmp 2-Roun増幅反応前後で評価しました。増幅していないRNAとTargetAmp 1-Round及びTargetAmp 2-Round増幅反応で作製されたaRNAは、ランダムプライマーとSuperscript III Reverse Transcriptaseをもちいて逆転写しました。EPICENTRE Biotechnologies' TAQurate GREEN Real-Time PCR MasterMixを用いて定量PCR (SYBR® Green detection) を行いました。Beta-2 microglobulinを発現レベルのノーマライゼーションに使用しました。RNAサンプル間での発現レベルの差は、qPCRサイクル(ΔΔCT)でのノーマラズされた ΔCT で表されています。下に示されている結果はTargetAmp 1-Roundと2-Round増幅反応は遺伝子の発現レベルを保存することを示しています。
Correlation of Differential Gene Expression (Fidelity of Amplification)
識別的遺伝子発現の相関を調べるために、6日間及び12日間培養されたmouse neural cellsのtotal RNAからTargetAmp 1-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 101とTargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0及びAffymetrix社の標準プロトコールを用いてbiotin-aRNAを作製しました。6日間及び12日間培養されたmouse neural cellsのtotal RNATotal RNAそれぞれ増幅され、400 pgのtotal RNAはTargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0で増幅されました。アミノアリルaRNAは、Biotin-X-X-NHSを用いてラベルされました。Affymetrix社標準プロトコールでは5 μgのtotal RNAを使用しました。
biotin-aRNAサンプルはAffymetrix社GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arraysにtriplicateでハイブリダイゼーションされました。 Differentially expressed genesは、GeneSpring software package (Silicon Genetics)をもちいて同定されました。Affymetrix標準プロトコールとTargetAmp 1-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 101 プロトコールで得られたexpression ratios をFigure 3A にプロッしました。correlation coefficientｂは0.90で、TargetAmp Kit 101 protocolとAffymetrix社標準プロトコールによって同定された発現遺伝子は一致しています。
TargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Kit 1.0プロトコールとAffymetrix社標準プロトコールによって得られたexpression ratioをFigure 3Bにプロットしました。correlation coefficientは0.89で、TargetAmp Kit 101 protocolとAffymetrix社標準プロトコールによって同定された発現遺伝子は一致しています。
Figure 3A. Differentially expressed genes identified using biotin-aRNA produced by the TargetAmp™ 1-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 101, and subsequent biotinylation, and biotin-aRNA produced by the standard Affymetrix T7 RNA polymerase protocol gave a correlation coefficient of 0.90.
The 'Y' axis shows 12-day vs. 6-day gene expression ratios obtained using biotin-aRNA target produced by the TargetAmp 1-Round Kit 101 protocol. The 'X' axis shows the 12-day vs. 6-day gene expression ratios obtained using biotin-aRNA target produced by the Affymetrix standard procedure.
Figure 3B. Correlation of differentially expressed genes identified by the TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0 protocol and the standard Affymetrix biotin-aRNA labeling procedure.
The 'Y' axis shows 12-day vs. 6-day cultured mouse neural cell gene expression ratios obtained with biotin-aRNA target produced by the TargetAmp 2-Round Kit 1.0 protocol. The 'X' axis shows the 12-day vs. 6-day gene expression ratios obtained with biotin-aRNA target produced by the Affymetrix standard procedure.
Quality Assessment on GeneChip® Arrays (3' to 5' Ratios and % Present Calls)
TargetAmp 1-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 101とBiotin-X-X-NHS で作製されたbiotin-aRNAの平均の3'/5'比及び% Present CallsをTable 3に示します。これらの値は、Affymetrix社が策定しているquality assessment guidelinesの範囲内に収まっており、TargetAmp Kit 101はAffymetrix社GeneChip Arraysを用いて高品質の発現プロファイルを得ることができることを実証しています。
Table 3. AA-aRNA produced using the TargetAmp™ 1-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 101, and subsequently biotinylated, produced high quality GeneChip Arrays as determined by Affymetrix quality assessment guidelines.
| Fold Amplification | 3’/5’ ratio GAPDH | 3’/5’ ratio β-actin | % Present Calls | Reproducibility (2 amplifications) |
| >5000 | 1.05 +/- 0.05 | 2.8 +/- 0.01 | 56.3 +/- 2% | 0.99 |
TargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification 1.0 プロトコールで作製されたbiotin-RNAもAffymetrix社GeneChipで評価を行いました。6日間及び12日間培養されたmouse neural cellsのtotal RNA（400 pg）は、それぞれTargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0を用いて増幅されました。アミノアリルaRNAはEPICENTRE社Biotin-X-X-NHSでラベルされました。ウィスコンシン大学Gene Expression Centerにてbiotin-aRNAはGeneChip社Mouse Genome 430 2.0 Arraysにtriplicateでハイブリダイゼーションされました。平均の3'/5'比及びPresent CallsはMAS 5 software (Affymetrix)を用いて決定されました（Table 4）。TargetAmp 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0及びBiotin-X-X-NHSで作製されたbiotin-aRNA targetで高品質のアレイデータを得ることができます。
Table 4. AA-aRNA produced using the TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0, and subsequently biotinylated, generated high quality GeneChip Arrays.
| Fold Amplification of Poly(A) RNA | Average 3’/5’ ratio GAPDH | Average 3’/5’ ratio β-actin | Average Present Calls | Reproducibility (2 amplifications) |
| >5 x 106 | 5.6 +/- 1.5 | 10.7 +/- 0.07 | 50.7 +/- 1% | 0.99 |
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