TargetAmp™ aRNA Amplification Kits

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マイクロアレイスライドは多くの細胞から抽出したRNAから5-10μgの標識ターゲット核酸を必要とします。しかしながら非常に少量の細胞から抽出したRNAでは最も正確なマイクロアレイデータが得られますが、非常に少量のサンプルから得たRNA量からは一般的にマイクロアレイ用として5-10μg標識核酸cDNAを得るには少なすぎるのが現状でした。結果として少数細胞から抽出したRNAにはマイクロアレイ解析に必要量のRNAを“増幅”する必要があります。

わずか1つの細胞からのmRNAを増幅できます！

ラットの後根神経節部から1細胞をレーザーキャプチャーしました。

TargetAmp™ 2-Round AA-aRNA Amplification Kit 1.0を使用して2つのレーザーキャプチャー細胞からAA-aRNAを合成しました。

TargetAmp™ 2-Round AA-aRNA Amplification Kit 1.0を使用して2つのレーザーキャプチャー細胞からAA-aRNAを合成しました。

TargetAmp™キットの特徴

• サンプル中のTotal RNAのmRNAを5,000,000倍まで増幅可能です
• 6時間で1-round Amplification、2日で2-round Amplificationが可能です
• 再現性のある増幅結果を提供します
• 低い余分の転写産物の検出が可能です
• 非特異的産物を低減します
• 改良型”Eberwine”直鎖RNA増幅法を利用しています
• オリゴアレイやcDNAアレイの際、高いシグナル強度用に最適化したアミノアリル-aRNA （アミノアリル-cRNA）を合成します
• 主要製薬会社のマイクロアレイグループで証明済みです
• SuperScript™ II & III 逆転写酵素（Invitrogen社）用に開発しています
• cDNA精製やピペット操作を少なくしていますので簡単なプロトコールです

サンプル中のTotal RNAのmRNAを5,000,000倍まで増幅可能

TargetAmp™ 1-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 101を用いて5,000倍以上のmRNAの増幅が可能です。TargetAmp™ 101は25ng細胞Total RNAからマイクログラム量のアミノアリル標識アンチセンスRNA（AA-aRNAまたはAA-cRNA）を合成できます。

Table.1
TargetAmp™ 1-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 101を使用して得たアミノアリル-aRNA （AA-aRNA） 収量。結果はキット中のHeLa Total RNAコントロールを使用して数回実験した平均値。

TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 1.0を使用して5,000,000倍以上のmRNAの増幅が可能です。TargetAmp™ 1.0は10pg全細胞RNAからマイクログラム量のアミノアリル標識アンチセンスRNA（AA-aRNAまたはAA-cRNA）を合成できます。

Table.2 TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 1.0を使用して得られたアミノアリル-aRNA （AA-aRNA） 収量。

結果はキット中のRat Brain Total RNAを使用して数回実験した平均値で1μg以下の非特異的増幅産物が“no-RNA”コントロール反応として検出しました。

TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 1.0を使用して5,000,000倍以上のmRNAの増幅が可能です。TargetAmp™ 1.0は10pg全細胞RNAからマイクログラム量のアミノアリル標識アンチセンスRNA（AA-aRNAまたはAA-cRNA）を合成できます。

6時間で1-round Amplification、2日で2-round Amplificationが可能

両キットは転写反応前にcDNA精製の必要性をなくし、ピペッティング操作の数を減らす為にリアクション成分を組み合わせることで労力を削減することが可能です。

再現性のある増幅結果を提供します

TargetAmp™は1細胞から抽出したTotal RNAからでも一貫した、再現性のある増幅結果をもたらします。

Figure.2　2つのサンプル細胞Total RNA　（それぞれRat Brain 背面神経節から採取した1つのLCMキャプチャーセル）がTargetAmp™ 2-Round Aminoallyl-aRNA Amplification Kit 1.0を使用して別々に増幅しました。

結果のアミノアリル-aRNAはCy3-NHSで標識されRatアレイにハイブリダイズしました。2つのアレイの相関蛍光強度の点在する座標は増幅過程の再現性をデモンストレーションする為に作成しました。一致係数は0.9932でした。

Low abundanceの転写産物(Low abundance transcripts)も検出可能

Rat brain Total RNAからTargetAmp™反応で合成したアミノアリル-aRNA をビオチンで標識し、CodeLink™ 10K rat arrayにハイブリダイズしました。その結果8,300以上スポットを検出しました（Present calls）。これは83%以上のスポットを検出したことになりますので、Low abundanceの転写産物でも検出可能なことを意味します。

非特異的産物を低減

Baugh, et. Al.（Nucl. Acids Res. 29, e29 （2001）） は最初に発表したRNA増幅プロトコールは希望のmRNA増幅産物に加え、たくさんのTemplate依存性反応産物が作成されることを発表しました。非特異的増幅産物の生成は希望した増幅RNAの“特異活性”を下げるだけでなくポリメラーゼ触媒反応中のヌクレオチドプールを使い果たす事によって希望した増幅RNAの収量を限定します。

TargetAmp™ Kitは非特異的増幅産物を削除する為、独自の試薬を利用し、かなりの高収量の増幅mRNAが得られます。

改良型”Eberwine”直鎖RNA増幅法を利用

TargetAmp™ Kitは改良型の簡潔な”Eberwine”直鎖RNA増幅法を利用しています。

その他ほとんどの”Eberwine”ベース法では必要となる、DNAライゲーションステップ、in vitro 転写反応前のcDNAの精製が必要ありません。さらにこのキットはEpicentre社の主力製品である、AmpliScribe™ High Yield in vitro転写テクノロジーを最も短時間で、非常に高収量なアミノアリル-aRNAを合成用できるよう最適化しています。

オリゴアレイやcDNAアレイ使用時に、シグナル強度が高くなるよう最適化したアミノアリル-aRNA （アミノアリル-cRNA）の合成

TargetAmp™ RNA Amplification Kitはアミノアリル標識アンチセンスRNA（AA-aRNAまたはAA-cRNA）を合成します。AA-aRNAがアミン反応ビオチン（e.g.,biotin-XX-NHS）やアミン反応Cy®, Alexa®やその他の蛍光色素と反応した後、標識ターゲットは他の市販（または自家製スポット）オリゴやGeneChip®やCodeLink™チップを含むcDNAチップにハイブリダイゼーション用として使用できます。

TargetAmp™転写反応では一部の標準のUTPヌクレオチドは5-（3-アミノアリル）-UTP（AA-UTP）に置換されます。反応中のAA-UTP：UTPの割合はAA-aRNAがBiotin-XX-NHSやアミン反応蛍光色素との結合後、シグナル強度が非常に高いくなるよう最適化しています。

ターゲット核酸の間接標識アミノアリル方法は以下を含むビオチン-NTPや蛍光-NTPの直接取り込み法を超える重要な利点があります。

• 1回のRNA増幅で合成されたアミノアリル-aRNAは分割して、異なるNHS-エステル（e.g. Cy3-NTS、Cy5-NHS）で個別に標識できます。
• アミノアリル-NTPはビオチン-NTPや蛍光-NTPを直接取り込むよりも、in vitro 転写反応で高収率でアミノアリル-aRNAと合成でき、効果的に取り込みます。
• AA-aRNAへのアミン-反応ビオチンや蛍光色素の結合によるターゲット標識はビオチン-NTPや蛍光-NTPの直接取り込み法に比べ非常に低価格にです。

cDNA精製やピペット操作を少なくした簡単なプロトコール

通常RNA増幅は数多くの反応、希釈ステップ、かなりの量の手作業を含める精製などを用い、非常に複雑の為、思わしくない結果、再現性の無い結果、低収率につながります。

TargetAmp™は試薬数やピペッティング数を最小限に抑え、試薬を希釈する必要はありません。
またin vitro 転写反応前にcDNA精製は必要ありません。さらにキットの試薬は色付きチューブで提供されており、最も簡単で市販品の中で最もユーザーフレンドリーなRNA増幅キットです。

TargetAmp™ 1-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 101

25ngの細胞Total RNA（1000細胞以上）からマイクログラム量のアミノアリル-aRNA（アミノアリル-cRNA）を合成できます。mRNAの5,000倍以上の増幅が可能です。

Kit Contents

（R）赤キャップ、（G）緑キャップ、（L）色なしキャップ

• （R）TargetAmp™ T7-Oligo（dT） Primer A
• （R）TargetAmp™ Reverse TranscriptionPreMix-SS
• （R）TargetAmp™ DNA Polymerase PreMix-SS 1
• （G）TargetAmp™ In Vitro Transcription PreMix B
• （G）TargetAmp™ T7 RNA Polymerase
• （G）TargetAmp™ T7 Transcription Buffer
• （G）アミノアリル-UTP
• （G）RNase-Free DNase I
• （L）DTT
• （L）HeLa Total RNA Control（40ng/μl）
• （L）RNase-Free Water

TargetAmp™ 2-Round Aminoallyl -aRNA Amplification Kit 1.0

1から250までの細胞からマイクログラム量のアミノアリル-aRNA （アミノアリル-cRNA）を合成できます。mRNAの5,000,000倍以上の増幅が可能です。

Kit Contents

（R）赤キャップ、（G）緑キャップ、（L）色なしキャップ

• （R）TargetAmp™ T7-Oligo（dT） Primer B
• （R）TargetAmp™ Reverse TranscriptionPreMix-SS
• （R）TargetAmp™ DNA Polymerase PreMix-SS 1
• （R）TargetAmp™ DNA Polymerase -SS 1
• （R）TargetAmp™ cDNA Finishing Solution-SS
• （B）TargetAmp™ Random Primers-B
• （B）TargetAmp™ RNase H-SS
• （B）TargetAmp™ T7-Oligo（dT） Primer C
• （B）TargetAmp™ DNA Polymerase PreMix-SS 2
• （B）TargetAmp™ DNA Polymerase-SS 2
• （G）TargetAmp™ In Vitro Transcription PreMix A
• （G）TargetAmp™ In Vitro Transcription PreMix B
• （G）TargetAmp™ T7 RNA Polymerase
• （G）TargetAmp™ T7 Transcription Buffer
• （G）アミノアリル-UTP
• （G）RNase-Free DNase I
• （L）DTT
• （L）HeLa Total RNA Control（40ng/μl）
• （L）RNase-Free Water
• （L）Poly（I）

• MessageBOOSTER™ cDNA Synthesis kit for qPCR
• ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit