T4 Polynucleotide Kinase, Cloned
アプリケーション
- 32Pまたは33PでDNAおよびRNAの5’末端を標識して、DNAシークエンシング、ブロットハイブリダイゼーション実験、およびMung Bean NucleaseやS1ヌクレアーゼなどを用いた転写産物のマッピング1,2。
- オリゴヌクレオチドリンカーやその他のDNA・RNA分子をリン酸化して、後続のライゲーションに、またはAMpligase® Thermostable DNA Ligaseによるライゲーション増幅反応。
- ゲル電気泳動やクロマトグラフィー用の標識化DNA・RNA分子量マーカーの調製
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)は、ATPのγリン酸を、ssDNA、dsDNA、RNAの5’ヒドロキシル基、およびヌクレオシドの3’一リン酸に転移する反応を触媒する酵素です。この酵素は3’ホスホリル化ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド3’一リン酸、デオキシリボヌクレオシド-3’,5’-二リン酸から3’リン酸を除去して3’ヒドロキシル基を生じる反応も触媒します。
- ユニットの定義
- 標準的な条件下、37℃で30分間に[γ-32P]-ATPから1 nmolの32Pを酸不溶性に変換するT4 Polynucleotide Kinase活性を1単位とする。
- 保存バッファー
- 50 mM Tris-HCl (pH7.5) 、0.1 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.1% Triton® X-100、1 mM DTTを含む50%グリセロール溶液
- T4 PNK 10X 反応バッファー
- 330 mM Tris-酢酸(pH7.8)、660 mM 酢酸カリウム、100 mM 酢酸マグネシウム、5mM DTT。アイソトープを使用しないアプリケーション用に10 mM ATP溶液を別途提供しています。
- 品質管理
- T4 PNKは、核酸の5’リン酸化アッセイにおいて試験されており、検出可能なエキソヌクレアーゼ活性、エンドヌクレアーゼ活性およびRNase活性がないことを確認しています。
参照文献
- Sambrook, J. et al. (1989) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- Chaconas, G. et al. (1980) Meth. Enzymol. 65, 75.