CRISPRを使用したコロナウイルス検出法

Posted: March 05, 2020

研究者が最近の新規のコロナウイルスの大流行と戦うために全力を尽くして前進している中、ウイルス検出にCRISPRベースのテストを使用する取り組みも進行中です。

この点で特に注目すべきは、Mammoth BiosciencesとCRISPRのパイオニアであるFeng Zhangが率いる2つの独立した取り組みです。 両グループは、サンプルからのウイルスRNAの検出にCRISPRテクノロジーを使用した使いやすい診断アッセイを開発しました。

コロナウイルス検出のためにCRISPRベースの診断がどのように支援しているかをここで説明します。

コロナウイルスとは？

コロナウイルスは、中程度の感染性ウイルスだけでなく、中東呼吸器症候群（MERS）および重症急性呼吸器症候群（SARS）を引き起こすウイルスを含むウイルスのファミリーです。中国の武漢省で最初に報告された症例で、これまでに特定されていない新しいコロナウイルスです。CDCのウェブサイトによると、このウイルスの正式名称はSARS-CoV-2で、この疾患は2019年コロナウイルス病（COVID-19）です。

コロナウイルスの感染は、感染者の呼吸飛沫を吸入することにより発生します。 さらに、同じファミリーのウイルスは、その感染力と重症度が大きく異なる可能性があるため、新しいコロナウイルスで公衆衛生への危険性を推定することは困難です。

症例数は世界中で着実に増加しており、世界中で約90,870例が確認されており、パンデミックのパニックが高まっています。これらの懸念のなかで、研究者たちはこの1か月間にコロナウイルスに関する500を超える研究論文を発表し、ウイルス株のゲノムをシーケンシングして病気の蔓延の根底にあるパターンを明らかにすることで熱心に取り組んできました。

治療法の開発に加えて、感染した人々の特定は、病気の蔓延を封じ込めるために極めて重要かつ緊急事項です。現在利用可能なコロナウイルス検査はqRT-PCRに基づいており、感染の診断には少なくとも4〜6時間（時にはそれ以上）が必要です。 この潜在的に致命的な病気の感染が容易なため、人間のサンプルからウイルスを迅速に検出するための使いやすいキットが必要です。

現在、CRISPRの研究者達は可能な解決策を強化しています。Mammoth Biosciencesの専門家とSHERLOCK Biosciencesの共同創設者は、サンプルから30〜60分でSARS-CoV-2 RNAを検出するCRISPRベースのプラットフォームを独自に開発しました。

CRISPRをコロナウイルス検出に使用する方法

CRISPRはその出現後、ゲノム編集ツールとして人気を博しましたが、研究者はすぐに診断におけるその可能性に気付きました。CRISPRメカニズムは、相補的なターゲットシーケンスを見つけるガイドRNAと正確な場所で切断するCas 9ヌクレアーゼに依存しています。 興味深いことに、代替のCasヌクレアーゼの研究のおかげで、CRISPRの機能は、サイト固有の切断ツールではなく、ロケーションファインダーとして過去数年で明らかになりました。

「CRISPRは基本的に、一種の具体的なワープロツールではなく、生物学の一種の検索エンジン（生物学のGoogleのような）として基本的に考えています。」 -Mammoth BiosciencesのCEOであるTrevor Martinは、前回のCRISPR Cuts podcast interviewで説明しました。

2つのヌクレアーゼ、Cas12aおよびCas13aは、CRISPR診断で特に人気があります。Cas12aはDNA固有ですが、Cas13aはRNAに作用します。メカニズムの一部は、Cas9のメカニズムに似ています。それはターゲット配列に相補的なガイドRNAが特異的結合に必要であり、Cas12a / Cas13aヌクレアーゼがその部位で切断します。 Cas12およびCas13ヌクレアーゼの興味深い特徴は、それらが他または副次的な切断活性を示すことです。ターゲットを見つけると、ヌクレアーゼは近くにある他の非ターゲット核酸分子も切断します。この特性を利用して、CRISPR診断の視覚的な読み取りのためのレポーターシステムを構築します。

コロナウイルス検出のためのSHERLOCKテクノロジーの使用

Feng Zhangのグループは2017年に、SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)と呼ばれるCRISPRベースの核酸検出技術を最初に報告しました。長年にわたってそれを精緻化した後、著者らは2019年に核酸の高感度検出にSHERLOCKを使用するためのプロトコルを公開しました。SHERLOCKテクノロジーの共同発明者であるOmar Abudayyeh と Jonathan Gootenbergへの以前のインタビューで、2人はCRISPR診断プラットフォームの基礎を説明しました。ここでpodcast interview hereを視聴できます。

ここで自由に利用できる彼らの最新のプロトコルでは、Zhang教授とチームはCOVID-19ゲノムからの2つの遺伝子、S遺伝子とOrf1abを標的としました。原理実証テストでは、チームは合成COVID-19ウイルスRNAフラグメントを使用しました。

COVID-19ウイルス検出用のSHERLOCK検出プロトコルは3つのステップになっています。：

1. Recombinase polymerase amplification (RPA) technologyを使用した合成ウイルスRNAの増幅、続いて増幅されたDNAのin vitro転写によりRNAにします。
2. Cas13ヌクレアーゼとSynthego提供の特定の配列をターゲットとするcrRNAを使用したRNA検出。
3. 特定の抗体バンドに標識された末端を持つ切断されたレポーターRNAを捕捉する、市販の紙の計量棒を使用した視覚的な色の読み取り。

「このようなラテラルフローの紙ベースの診断は、プラットフォームのモジュール性により、アプリケーションに応じて読み出し値を交換できるため、非常に強力です。」-以前のCRISPR CutsインタビューでSHERLOCK Biosciencesの共同創設者であるOmar Abudayyeh氏談。

研究者たちは、このプロトコルを使用して、コロナウイルスの標的RNAシーケンスを10〜100コピー/ μlインプットの感度で検出できることを示しました。彼らは、この技術は特別な機器を必要とせずに1時間未満で患者のサンプルから精製されたRNAをテストするために使用できると述べています。

Feng Zhangとチームのプロトコルからの画像で、ラテラルフローストリップの読み出しを示しています。2つの遺伝子のそれぞれについて、異なるRNA濃度をテストしました。 検出バンドは、テストの感度の限界が10〜100コピー/ μlであることを示しています。

現在、プロトコルは実際の患者のサンプルを使用して検証されていませんが、研究者は、他の人が検証テストを実行したい場合のガイダンスとして利用できることを指摘しています。

Mammoth BioscienceがコロナウイルスRNAの検出にDETECTRプラットフォームを採用

2018年、Mammoth Biosciencesの共同創設者は、Cas12aを使用した高感度なDNA検出のための新しい方法、DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR)を報告しました。

Mammoth Biosciencesは先月、約30分でSARS-CoV-2 RNAを検出するためにDETECTRプラットフォームをどのように適応できるかについてのホワイトペーパーを公開しました。このような迅速な診断プラットフォームは、空港や病院などのリスクの高いエリアで特に価値があります。

Mammoth Biosciencesのホワイトペーパーの画像。異なる時間間隔でのラテラルフローストリップの読み出しを示しています。テストバンドは2.5分のマークで確認でき、その後鮮明になります。

Mammoth Biosciencesは、人為的サンプルのSARS-CoV-2ゲノムから、N遺伝子とE遺伝子の2つの遺伝子のCRISPRベースの検出をテストしました。テストの詳細と結果は、このホワイトペーパーに記載されています。

1. 逆転写ループを介した等温増幅（RT-LAMP）を使用して、サンプルから抽出された（この場合は、人為的サンプル）RNAの増幅。
2. Cas12aおよびSynthego提供の特定の配列をターゲットとするcrRNAを使用したDNAの検出。
3. 市販のディップストリップを使用した目視読み取り。

Mammoth Biosciencesチームは、その方法をSHERLOCKベースのプロトコルと比較して、Cas13aベースの検出に必要な追加のIVTステップの時間を節約したためプラットフォームがより高速な検出（60分ではなく30）を可能にしたことに注目しました。DETECTRプラットフォームの感度範囲は、70〜300コピー/ μlインプットです。

Mammoth Biosciencesのホワイトペーパーからの画像。ワークフロー時間をDETECTR、SHERLOCK、および現在のCDC / WHO検出方法と比較しています。

CRISPRのブレークスルーを実現するSynthegoの取り組み

Synthegoの使命は、科学者がCRISPRを使用して発見したものに変化をもたらすことを可能にすることです。診断プラットフォームで使用するための高品質のsynthetic guide RNAsでMammoth BiosciencesとFeng Zhangのチームをサポートできたことを誇りに思います。今後も、CRISPRの診断と治療をサポートするために、研究者や機関とのパートナーシップを維持していきたいと考えています。

コロナウイルスがパンデミックになるかどうかはまだわからないままですが、科学の進歩により、疾病対策に期待が寄せられています。SHERLOCK Biosciencesは最近、将来の病気の発生に備えて、より良い準備のために診断プラットフォームで協力するためのCepheidとのパートナーシップを発表しました。

About the Author
Meenakshi Prabhune, Ph.D.
Meenakshi Prabhune, a science writer and journalist, manages the Synthego blog content. In her free time, one can find her traveling to new places or binge-watching Netflix shows on her couch (both are equally probable). Follow Meenakshi on Twitter (@minu_pr) for her latest updates.