ProPrep™ Mini
核酸精製キット
ProPrep™ Mini kitはLigoChem社独自の高い安定性完全蛋白除去試薬ProCipitate™を基本成分としたマイクロ遠心チューブ精製システムです。“ProCipitate™”は不純物を取り除きDNAのみを残す事により剪断を最小限に押さえかつ収量を上げ自動蛍光シークエンス用のPlasmidやBACの鋳型調製に最適の高品質DNAが得られます。このキットは2ml培養液を使用し、修飾アルカリライシス法の中で“ProCipitate™”を使用します。
特徴
- Sequencing Quality
- 1.5-2.0μg BAC/prep
- トランスフェクションにも使用できます。
- スケールアップ/ダウンできます。（10ml培養液の場合は標準プロトコールの5倍使用してください。200mlの場合はProPrep™ Omni Kitをお勧めします。)
BigDye™ terminator (PE Biosystems) を用いたBACシークエンス
プロトコール（2ml培養液の場合）
- LLB培地または2X YT培地（BAC用、20μg/mlクロラムフェニコール）Overnightにて初期静止期、濃度2→4X109まで1.5-2.0ml培養します。（2XYT培地はLB培地より約50%収量が高くなります。TB培地はお勧めできません。）
- 4,000xg、2分間遠心にて集菌し上清を捨てます。それぞれのウェルにTE1 Resuspension Buffer 120μlとRNase cocktail 9μｌを入れVortexによりよく混合します。
- AL2 アルカリ溶解液120μlを加え軽く混合し2分間室温で静止します。（Vortexはしないで下さい。）
- NB3中和液120μlを加え軽く混合し3分間室温で静止します。（Vortexはしないで下さい。）
- 予めProCipitate™の固相を良く混合させておき、広口のピペットを用いてそれぞれのサンプルにProCipitate™™ 80μl加え広口ピペットを使用して5-10回ピペットで混合し2分間室温で静止します。
- 4,000 x G, 2分遠心にて沈殿させます。新しい遠心チューブに上清を移します。
- 100%イソプロパノール200μl加え3-4回転倒混合し20分間室温で静止します。
- DNAをペレットにするため14,000 x G、 15分遠心し上清を捨てます。
- ペレットをつぶさないようにチューブの側面に70%エタノール（室温）200μlを加えペレットを洗浄します。（もしペレットがつぶされたら再度14,000 x G, 10分遠心してください。）
- 上清を捨てそれぞれのウェルに残存している水滴が見えなくなるまでペレットを吸引乾燥します。
- それぞれのサンプルに30-50μlの脱イオン水を加え再溶解させます。
詳細なプロトコール［PDF 324KB］
References
- U.S. Patent Numbers 5,294,681, 5,453,493 and other patents pending.
- Huang, G. M., et al, A High-Throughput Plasmid DNA Preparation Method, Analytical Biochem, 223:35-48, 1994.
- Kelly, J. M., et al, High Throughput Direct End sequencing of BAC Clones, Nucleic Acids Research, Vol.27, No.6:1539-1546, 1999.
- http://www.hgmp.mrc.ac.uk/ISO9000/BIOLOGY/LIBRARIES/pig_BAC/procipitate.shtml
- PE Biosystems User Bulletin. Subject: Sequencing Large DNA Templates.
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