ProPrep™ BAC 96

核酸精製キット

ProPrep™ BAC 96 kitはLigoChem社独自の高い安定性完全蛋白除去試薬ProCipitate™を基本成分としたシステムです。“ProCipitate”は不純物を取り除きDNAのみを残す事により剪断を最小限に押さえかつ収量を上げ1.5ml 2xYT培地から自動蛍光シークエンス用の高品質DNAが得られます。またProPrep BAC 96-Aのプロトコールは1.5mlのover night cultureを用い最初の集菌後、遠心不要のため簡単に自動化へ適用できます｡

特徴

Sequencing Quality
高収量：1.5-2.0μg BAC DNA/prep
トランスフェクションに使用できます｡
自動化に最適
自動化に最適・ABIのUser BulletinにてBAC用精製キットとして紹介されています。

Applied Biosystems社が推奨するLarge template DNA用のプロトコールに従いBigDye™ terminatorsを使用してBAC end sequenceを行いました。

プロトコール（1.5ml培養液の場合）

LB培地または2X YT培地(20μl/ml クロラムフェニコール)にて初期静止期まで（濃度2→４X109まで）350μl培養します。（２XYT培地はLB培地より約50%収量が高くなります。TB培地はお勧めできません。）
2,000xg、10分間遠心にて集菌し上清を捨てプレートの表面を乾燥させます。
それぞれのウェルにTE1 Resuspension Buffer 120μlとRNase cocktail 9μｌを入れVortexによりよく混合します。
AL2 アルカリ溶解液120μlを加え軽く混合し2分間室温で静止します。（Vortexはしないで下さい。）
NB3中和液120μlを加え軽く混合し5分間室温で静止します。（Vortexはしないで下さい。）
予めProCipitate™の固相を良く混合させておき、広口のピペットを用いてそれぞれのサンプルにProCipitate™ 80μl加え広口ピペットを使用して5回ピペットで混合し2分間室温で静止します。
それぞれのサンプルを96ウェルフィルターPlateのそれぞれのウェルに移動させ,18-20”Hgで吸引ろ過します。ろ過液にDNAが含まれています。
イソプロパノールにて回収します。

詳細なプロトコール［PDF 418KB］

References

U.S. Patent Numbers 5,294,681, 5,453,493 and other patents pending.
Huang, G. M., et al, A High-Throughput Plasmid DNA Preparation Method, Analytical Biochem, 223:35-48, 1994.
Kelly, J. M., et al, High Throughput Direct End sequencing of BAC Clones, Nucleic Acids Research, Vol.27, No.6:1539-1546, 1999.
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/ISO9000/BIOLOGY/LIBRARIES/pig_BAC/procipitate.shtml
PE Biosystems User Bulletin.Subject: Sequencing Large DNA Templates.

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