Plasmid-Safe™ ATP-Dependent DNase

クローニング

Plasmidやcosmid、BACクローン調製に残っている細菌染色体DNAを簡単、迅速、強力に除去します。この酵素は中性pHで、linear-dsDNAやclosed環状ssDNAとlinear-ssDNAを分解し、nicked及びclosed環状dsDNAは分解しません。

CsCl/Etbr法で精製しても、Plasmidとcosmidには少量の細菌染色体DNAやアルカリ変性溶菌によるlinear-ssDNAが混入しており 、特にクローニングベクターがlow-copy-number plasmidやcosmidの場合はクローンDNAを認識するのが難しく、クローンDNAのシーケンスやサブクローニングが困難になります。

Plasmid-Safe™はplasmidやcosmidの最終精製手段として用いることにより、CsCl/Etbr精製よりもきれしいなゲルバンドが得られます。この酵素で調製したplasmidやcosmidは環状DNAの形成を高め、混入DNAのサブクローニングやシーケンスの可能性を最小に抑え、トランスフォ一メーションの効率を最高にします。反応完了後、70℃、30分間のインキュベーションで酵素は失活します。

• プラスミド、コスミド、BACベクター調製の品質を改善し、クローニングやシーケンスでDNAの汚染を極力抑え形質転換効率を 高めます。
• 迅速な容易なプロトコールです。

1. 標準的な方法でプラスミドDNAをバクテリアから抽出します。
2. ペレットDNAを1x Pｌasmid-Safeバッファーに懸濁させ、ATPを最終濃度1mMになるよう加えます。
3. Plasmid-Safe DNaseを反応液に加えます。
   1-5ml 培養液では 10 Unit
   500ml 培養液では 100 Unit
4. 37℃で次の時間インキュベートします。
   1-5ml 培養液では 15分間
   500ml 培養液では 2時間
5. 75℃、30分間のインキュベーションによりPlasmid-Safe DNaseを失活させます。

Plasmid-Safe DNaseによる分解は、プラスミドやコスミドから混入染色体DNAを取り除くための簡単便利な方法です。この酵素活性には中性pH、10mM Mg²⁺と1mM ATPが必要です。Plasmid-Safe DNaseによる分解はATP存在下多くの酵素バッファーで直接に行えます。便利なことに、Plasmid-Safe DNase分解工程は、プラスミド、コスミド精製工程のどの段階にでも加えることができます。しかしながら最高の酵素活性と最短の分解時間で行うには、標準的なDNA抽出工程の完了後、使用して下さい。

注意

処理したDNAは、更にエタノール沈澱、スピンカラム、有機抽出により精製出来ます。もし染色体DNAの混在量が予測できるならば、正確な量のPlasmid-Safe DNaseを精製DNA溶液に加えることができます。これはアガロースゲル電気泳動を可視化するための溶液のaliquotに準じて推定できます。次に酵素の添加量は次の換算により計算できます。Plasmid-Safe DNaseの3ユニットは37℃、30分間で1μgのDNAを分解します。 代表的なアルカリ溶解法でプラスミドDNAを抽出した場合に含まれている染色体DNAは一般的に充分にニック化され切断されているので、Plasmid-Safe DNaseの良い受媒質になります。しかしエクソヌクレアーゼが作用する位置が僅か2つしかないので、相対的に無傷のDNAは徐々に変性されます。この状態の解決策はPlasmid-Safe DNase分解の前に、プラスミドやコスミドを切断しない制限酵素を用いて染色体DNAを切断します。あるいは染色体DNAを機械的にvortexや小さいマイクロピペッターチップでピペッティングすることで切断します。 Plasmid-Safe DNaseによる分解は、1/10量の添加でもovernightインキュベーションを行えば可能です。

10×反応液及び25mM ATP添付

反応液組成

330mM Tris-acetate, pH7.8, 660mM potassium acetate, 100mM magnesium acetate, 5.0mM DTT
以上の混合液にATPを加え、最終濃度を1mM ATPにします。

保存温度

-20℃

保存液組成

50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.1M NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% TritonX-100, 50% glycerol

活性の定義

上記活性反応液を用いて、37℃、30分間にlinear-dsDNAの1nmoleのデオキジヌクレオチドを酸可溶物に転換する酵素量を1unitとする。

Figure 1.一本鎖DNAの除去にPlasmid-safe™の使用

SmaI制限酵素処理した細菌DNAと無傷プラスミドDNAを10U Plasmid-Safe™,30分,37℃インキュベートしました。（1%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色しました。）

レーン1：

マーカー(1k base)

レーン2：

SmaI制限酵素処理した細菌染色体DNA3μg

レーン3：

500ngプラスミドDNA

レーン4：

3μg細菌染色体DNA+500ng プラスミドの混合

レーン5：

染色体DNAとプラスミドDNAの混合液をPlasemid-Safe処理したもの

Figure 2.ホワイトコロニーの形成を左右する一本鎖DNAの除去について

EcoRI制限酵素処理した細菌ゲノムDNA3μgとsupercoiled pBS SK+ (Stratagene)2μgを混合し”ブルーホワイト”ス クリーニングアッセイをしました。

そのうち半分のDNAをPlasmid-Safe処理（図2：左）、残り半分をコントロールとしてPlasmid-Safe™未処理（図2：右） した。

Plasmid-Safe™を熱失活させた後、DNAは EcoRIで制限酵素処理し、T4 DNA Ligase (Epicentre) でovernightライゲーシ ョンした後、Nova Blueコンピテントセル(Novagen)へトランスフォーメーションさせた。（IPTG/X-gal-mediaにて）

ブルーコロニーはプラスミドが再環状化していることを示しています。

ホワイトコロニーはDNAがプラスミドへ挿入されていることを示しています。

（図2：プレートA）はPlasmid-Safe™によりわずか1-3%ホワイトコロニーが形成されていますが、（図2：プレートB）では50%以上ホワイトコロニーが形成されています。

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