FailSafe™ Real-Time PCR System

FailSafe™リアルタイムPCRシステムは、卓越した特異性、感度および一貫性をもつFailSafe™PCRシステムの性能をいかし、定量PCRに適したPCRシステムです。FailSafe™リアルタイムPCRシステムはPCRの際に増幅される2本鎖DNAの検出にSYBR® Green I dyeを取り込みます。DNA合成の各段階で、SYBR® Green I dyeはPCR増幅産物に結合します。また、amplicon量はその蛍光測定によりリアルタイムでモニターできます。SYBR Green I dyeをリアルタイムPCRで取り込ませる場合、ターゲット特異的プローブを用意する必要がないため非常にフレキシブルです。

FailSafe™リアルタイムPCRシステムはFailSafe™PCR酵素ミックスを使用しています。ユニークな熱安定性酵素のブレンド酵素で、非常に高感度で、かつ正確性が高く、増幅が最も困難なDNAテンプレートをも増幅できます。これにより、目的のPCR産物を非特異的増幅産物でコンタミさせることを最小限におさえます。

このシステムには、広範囲でテストし、様々なPCR条件をもたらす12種類のFailSafe™ PCR "PreMixes"セットが組込まれています。これらのPreMixesには、定量PCRを成功させるために必要となるSYBR® Green I dye、dNTPs、12種類のバッファーはそれぞれ濃度を変えたMgCl2、FailSafe™ PCR Enhancer (ベタイン含有)*を備えております。また、システムの中には、ABI社のリアルタイム機器をご使用になる場合SYBR® Green dye反応中にシグナルを正常化させるpassive reference fluorescent dye (ROX)が含まれています。

*EPICENTREの特許製品

初回

テンプレートおよびプライマーを用意してFailSafe™ Real-Time PCR PreMix Selection Kitを使用してリアルタイムPCRします。テンプレートの増幅に最適なPreMixを選んでください。

その後毎回の定量PCRに

初回時に選択したPreMixと FailSafe™ Real-Time PCR Systemを用いて一貫した定量PCRをテンプレートおよびプライマーで行います。

Application

正確、信頼できるリアルタイムPCR

Benefits

• 非常に高感度および特異性のあるユニークな酵素ブレンドを使用。およびFailSafe™ PCR Enhancerテクノロジー(図1および2を参照ください)。
• 初めてのリアルタイムPCRも毎回行うリアルタイムPCRも成功します。
• 使いやすいPreMix solutionは、SYBR® Green I dyeを使用する定量PCRに必要なコンポーネントをすべて含んでいます。
• 特異的なプローブの必要はありません。
• ROXがキットに含まれます。

図1. FailSafe™ リアルタイムPCRシステムでより高感度

キットA

FailSafeリアルタイムPCRシステム

コピー数0、1、10、100、10³、10⁴ 、10⁵また10⁶のラムダDNAを用いてFailSafe™ リアルタイムシステムと競合社製品 （キットA）のホットスタートからのリアルタイムPCRの比較を行いました。CII遺伝子の460-bp断片を増幅し、リアルタイムPCR増幅はBio-Rad社 iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection Systemで行いました。

パネルA
図2. FailSafe™リアルタイムPCRシステムでより高い特異性リアルタイムPCR

キットA

FailSafeリアルタイムPCRシステム

ヒトDMDエクソン43から357-bp断片のPCR増幅を、ゲノムDNA100 ng用いて、FailSafeリアルタイムシステムと競合社製品 (キットA)のホットスタートからのリアルタイムPCRを比較しました。 パネルA はFailSafe™リアルタイムPCRシステムおよびキットAから得たリアルタイムPCR産物のmelting curve分析です。 パネルB上記2つのキットから得たPCR産物のアガロース・ゲル電気泳動分析。反応はBio-Rad社 iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection Systemで行いました。

* Covered by issued and pending patents.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. SYBR™ Green I Dye is covered by patents.

EPICENTRE’s PCR products are sold under licensing arrangements with F. Hoffmann-La Roche Ltd., Roche Molecular Systems, Inc., and Applied Biosystems. The products containing a thermostable DNA polymerase are accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain Reaction (PCR) and RT-PCR for life science research in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process is covered by the up-front license fee, either by payment to Applied Biosystems or as purchased, i.e., an authorized thermal cycler.

内容：

• FailSafe™ PCR酵素ミックス
• FailSafe™リアルタイムPCR 2X PreMixes 12種類（各1本/計12本）
• Passive Reference Dye (ROX)

内容：

• FailSafe™PCR酵素ミックス
• FailSafe™リアルタイムPCR 2X PreMixes （12種類中2本選択）
  （ご注文の際に2本選択してください。PreMixは単品でのご注文はできません。）
• Passive Reference Dye (ROX)

現在real-time PCR法には2つのベーシックな手法があります。第1の手法は、標識プローブ(ABI TaqMan)がプライマーのアニール時に蛍光発光するもので、結果はプライマーの特異性に非常に依存します。別の手法は、すべてのdsDNAに結合するSYBR® Green dyeを用いるものです。SYBR® Green法は標識プローブにとって変わる方法で迅速かつ簡便、特異的プライマーや標識プローブを必要としないため低価格です。

real-time PCRは長いDNAテンプレート(>500 bps)の増幅も可能、検出には通常短いDNAテンプレート(100-150 bps)で十分なため、サイクル･タイムも通常のPCRと比べ短く(<60秒) 迅速です。

real-time PCRのサイクル回数は通常よりも多く(40-50 vs. 25-30)、これは微量なスターティング･テンプレートから少容量のDNAより検出を試みているためです。

Key Benefits

FailSafe™ Real-Time PCRの利点は、オリジナルのFailSafe™と同様に必ず結果が出るもしくはほとんどの場合、他に比べて結果がよいということです。競合製品は数多くあるDNAテンプレートの中でいくらか結果を出せるシングル・コンポーネントで、これらのキット(Bio-Rad & Roche)はMgCl2の濃度変更ぐらいでしか改善することができません。そして、更なる最適条件を検討しなければなりません。しかし FailSafe™ ブレンド酵素と12本の異なるPreMixes は、既にすべてのDNAテンプレートをカバーできる構成になっています。また PreMixes はready to use（調製不要のsolution）なので操作の手間が省けます。

1. 今のDNAテンプレートで増幅できないものはありますか？
2. DNAテンプレートでもっとよい結果を必要とするものはありますか？

それならばFailSafe™ Real-Time PCRがお役に立ちます。

Suggested Protocol

1. チューブ/ウェル中で混合します

注意:ピペッティング操作を減らすには、上記のFailSafe™ PreMix を除いた全てをひとつのチューブでよく混合した後、25.0 μlずつ12ウェルに分注し、12種類FailSaf™ PreMixを25.0 μlずつそれぞれのウェルに分注します。キットに含まれるROXは1:50でTE bufferにて100X希釈しております。4℃で一週間安定です。

2. サーマルサイクラーの設定

• denature：95 ℃ 1-2 minutes
• anneal：2-5 ℃ below Tm for 10-60 seconds
• extend：68-72 ℃ for 30 seconds (<500 bps templates)

注意：FailSafe™ではホット･スタートは使用しないでください。

使用可能機器

• ABI (Prism)
• Roche (LightCycler)
• Bio-Rad (iCycler)
• Stratagene (Mx 4000)
• MJ Res (Opticon)
• Cepheid (Smart Cycler)
• Phoenix Res/Corbert (Rotor Gene RG2000/3000)

製品のご購入・ご相談はTEL:03-3545-5720、またはお問い合わせまで。