EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2> Tnp Transposome™ Kit

transposon mutagenesisの利点は、トランスポゾンが分裂するゲノムDNA領域をクローニング及びシーケンスする際にマーカーとして利用できる点です。このクローニングプロセスにおいてEZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kitを用いるのがin vivoでmutationを作製する最も簡単な方法です。kanamycin-resistance geneを含んでいるのに加えtransposonはE.coliのorigin(R6Kγori)を含んでいます。このoriginはtransposonが挿入されているゲノムDNA領域を増幅もしくは"rescue"することができます。

初めにTransposomeをelectrocompetent cellにエレクトロポレーションすることにより、ホストのgenomic DNAにランダムにtransposonが挿入されます。transposition cloneをカナマイシンプレートで選択するか、遺伝子機能が欠損しているものをスクリーニングします。

transposon insertion site のrescue cloneは以下3つのステップで行います。(Figure 1):

1. カナマイシン耐性のクローンからgenomic DNAを精製し、endonuclease処理もしくはrandom shearingによりDNAを断片化します。
2. using Fast-Link™ DNA Ligaseもしくは他のligaseを用いてgenomic DNA fragmentをself-ligationさせます。randomly sheared DNAのligation効率を高めるためには、DNAの両末端を修復するEnd-It™ DNA End-Repair Kitをligation時に使用します。
3. π蛋白質(pir gene product)を発現するE.coli,（TransforMax™ EC100D™ pir+ もしくはTransforMax™ EC100D™ pir-116 Electrocompetent E.coli）に形質転換し、カナマイシンにて選択します。EZ-Tn5 ＜R6Kγori/KAN-2＞ Transposonが挿入されているクローンのみ成長します。

Rescue clones can be sequenced bidirectionally using the provided primers that are homologous to the ends of the transposon.

Note: rescue cloningのための独自のEZ-Tn5 Transposonを作製するにはEZ-Tn5™ pMOD™-3 or pMOD™-5 ＜R6Kγori/MCS＞ Transposon Construction Vectoを使用して作製できます。

Figure 1. The process for rescue cloning of transposon insertion sites in genomic DNA using the EZ-Tn5™ ＜R6Kγori/KAN-2＞Tnp Transposome™ and TransforMax™ EC100D™ pir+ or TransforMax™ EC100D™ pir-116 Electrocompetent E. coli.

Based on user suggestions, we will gradually replace the "EZ::TN™" name by "EZ-Tn5™" so it will be easier to distinguish our hyperactive Tn5-based transposon products from our "HyperMu" transposon products.

Includes unlabeled forward and reverse sequencing primers.

Includes control vector containing an R6Kγori.

Genotypes

TransforMax EC100D pir⁺ Electrocompetent E. coli for maintenance of plasmids at approximately 15 copies per cell: F^- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ^- rpsL nupG pir⁺(DHFR).

Includes control vector containing an R6Kγori.

Genotypes

TransforMax EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli for maintenance of plasmids at approximately 250 copies per cell: F^- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ^- rpsL nupG pir-116(DHFR).

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