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CRISPRcraft™ S.p. Cas9 Nuclease

  • NLS配列を持つ組み換えのStreptococcus pyogenes Cas9 nuclease
  • Cas9/gRNA複合体の効率的なRNP導入に適しています。
  • 高濃度(10 mg/mL, 62 μM)で提供しますので、様々な導入方法に利用できます。
  • 活性と純度を確実にするために詳細な品質管理にて製造

CRISPR-Cas9 gene editing はCas9 ヌクレアーゼの活性により引き起こされます。Cas9は、ターゲットの遺伝子にCas9を向ける小さな(約97nt)ガイドRNAと供にRNP複合体を形成することにより、二本鎖DNAの配列特異的切断を触媒します。 この正確なDNA切断は、ゲノム編集、CRISPR媒介DNA検出、配列濃縮および喪失を含む様々なin vivoおよびin vitroでのアプリケーションを可能にします。

CRISPRcraft™ S.p. Cas9 Nuclease は、wild-type Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease由来で大腸菌組み換えにより生産・精製され、C末端6xHis tagとCmattan NLS配列を有します。CRISPRcraft™ S.p. Cas9 Nuclease は、脂質ベースのトランスフェクションやエレクトロポーレーションで利用できるように高濃度 (10 mg/mL, 62 μM)で提供出来ます。 (Figures 1 and 2).

Figure 1: CRISPR RNP delivery.

HEK293T cells were transfected in triplicate with RNP containing CRISPRcraft™ S.p. Cas9 Nuclease and guide components from the CRISPRcraft™ S.p. Cas9 Nuclease Control Kit targeting HPRT, using either lipofection or electroporation. Transfection conditions: TransIT-X2® Dynamic Delivery System (Mirus), 50 nM gRNA and 25 nM Cas9; Lipofectamine® RNAiMAX (ThermoFisher Scientific), equimolar Cas9 and gRNA at 25 nM; Ingenio® Electroporation Solution (Mirus), 1.5 μM gRNA and 0.75 μM Cas9, plus Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer (IDT). At 48 hours post-transfection, cleavage efficiency at the HPRT locus was determined using the T7E1 mismatch detection assay and is expressed as % gene modification.

Figure 2: In vivo gene editing with different guide RNA sequences.

HEK293T cells were independently transfected in triplicate with RNP containing CRISPRcraft™ S.p. Cas9 Nuclease and three different guides, each targeting a different loci within human HPRT. Transfections were performed using TransIT-X2® Dynamic Delivery System (Mirus), 20 nM guide and 10 nM Cas9 (2:1 guide:Cas9 molar ratio). Cleavage efficiency at each HPRT locus was determined using the T7E1 mismatch detection assay, 48 hours post-transfection.

Table 1. CRISPRcraft S.p. Cas9 Nucleaseの品質管理仕様

アッセイ 仕様
純度 ≥ 95%, by SDS-PAGE
エンドトキシン ≤ 10 EU/mg, by LAL
エンドヌクレアーゼ活性 < 10% nicking(アガロース電気泳動)
エクソヌクレアーゼ活性 DNA分解は未検出(アガロース電気泳動)
RNase活性 < LOD (fluorescence-based assay)
DNA Contamination < LOD(アガロース電気泳動)
活性アッセイ 2nM 直鎖ターゲットDNAの<80%を20nM S. p. Cas9と同モルのguide RNAにて37℃、10分で切断
製品名 型番 容量
CRISPRcraft S.p. Cas9 Nuclease, 10 mg/mL (62 µM) 70020-1 120 µg
70020-2 400 µg
CRISPRcraft S.p. Cas9 Nuclease Control Kit 70030-1 10 rxns

CRISPRcraft S.p. Cas9 Nuclease Control Kitには、Cas9 Control HPRT Guide crRNA, Cas9 Universal tracrRNA, Human HPRT Forward and Reverse PCR Primers, Control HPRT Substrate DNA, 10X RGEN Bufferが含まれます。Control KitにはCas9 enzymeは含まれません。

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