ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kit

ナノスケールRNA精製

マイクロダイセクションで採取した微量・少数細胞からのRNA精製キット。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ LCM ）で採取した1〜数千の微量の真核細胞からRNAを抽出するために必要な試薬をすべて提供します。試薬は毒性を持つ有機溶剤を使用せず、全てが溶液から成っています。このキットのナノ規模プロトコールは、1〜10,000 cellsの真核細胞における量的リアルタイムPCRでテストし開発しました。1,000 および10,000のHeLa細胞からのRNA平均収率は、RiboGreen®蛍光色素により決定し、それぞれ21および213ngでした。さらにaRNA2ラウンド合成テクニックを使用してHeLa細胞20個からmg量のRNAを合成できます。

Applications

• RT-PCR
• aRNA
• LCM (Laser Capture Microdi s section)

Benefits

• 1個（それ以上）の細胞からRNAを分離します。
• aRNA合成用RNAの精製
• シンプル、有機溶剤を使用しないプロトコール

Figure 1. 定量リアルタイムPCR伸長プロファイル

インタクトHeLa細胞の成長培地を数回にわたって10倍づつ希釈した。104、103、100、10、0 (培地コントロール) 細胞/チュー ブ (注意: 生細胞を実際の希釈したものであり、他社で行っている細胞溶解物の希釈ではない) 。各チューブのRNAを ArrayPure™ Nano-scale RNA Purification Kitを用いて精製。精製HeLa RNAはEPICENTRE社 MMLV reverse transcriptaseを用いてcDNAに逆転写。これに相当するcDNAsをFailSafe™ Real-Time PCR Systemおよび SYBR® Green Iを用いてBio-Rad iCycler iQ™ Real-Time PCR Detection Systemにて定量。サイクル条件は95°Cで2分の後、45サイクルを95°Cで20秒、53°Cで30秒、72°Cで30秒行った。プライマーはヒト cyclophilin A (peptidylprolyl isomerase A) 5'- CAT ACG GGT CCT GGC ATC TTG and 5'- GCC ATT CCT GGA CCC AAA GC。 Red＝10,000 cells、Blue＝1,000 cells、Pink＝100 cells、Green＝10 cells

Figure 2. CT値：イニシャルHeLa細胞数のLog値の直線プロット

10、100、103、104のHeLa細胞から精製されたRNAを用い、合成されたcDNAのイニシャル細胞数のLog値はCT値に対抗してプロッ トされました。

スロープ: -3.75; r2 = 0.991。直線CT値はイニシャル細胞数に比べ4桁づつ伸びています。

Figure 3. 定量リアルタイムPCRプロット

HeLa細胞を無菌の状態で培養しました。細胞数は倒立顕微鏡にて確かめました。ArrayPure™ Nanoscale RNA Purification Kitを用いてHelLa細胞のRNAを精製しました。精製HeLa RNAはEPICENTRE社 MMLV reverse transcriptaseを用い てcDNAに逆転写。これに相当するcDNAsをFailSafe™ Real-Time PCR Systemを用いてBio-Rad iCycler iQ™ Real- Time PCR Detection Systemにて定量。サイクル条件は94°Cで2分の後、35サイクルを95°Cで10秒、60°Cで10秒、72°Cで30秒 行った。プライマーは、ヒトbeta-actin5'- TGG ACA TCC GCA AAG ACC TG と 5'- CCG ATC CAC ACG GAG TAC TT. TaqManプロー ブは、5'- TET-CAC CAC CAT GTA CCC TGG CAT TGC C-BHQ1.

100, 10, 1 and 0 （培地のみ） cellsからのRNAに対して示しています。

Figure 4. イニシャルHeLa細胞数のLog値に対するCT値のプロット

100、10、1のHeLa細胞から精製されたRNAを用い、合成されたcDNAのイニシャル細胞数のLog値に対して、CT値をプロットしました。

スロープ = -3.14、 r2 = 0.992。

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