AmpliScribe™ T7, T3, and SP6 High Yield Transcription Kits

• 高い転写効率一般の転写や反応と比べ30倍のRNAが迅速に合成できます。
• 100べース以下から数Kbまでのcapped RNA、ビオチンやシゴキシゲニン標識プロー ブの合成に最適です。(Fig.3,4,5,6)
• 迅速2時間以内

in vitro transcription反応によって、最大量のCap及びUncapのRNAを得ることができます。鋳型DNAに左右されますが従来法と比べ10-30倍のRNAが得られます。1μgの鋳型 DNAを含む20μlの反応液で2時間以内にほぼ100-160μg(5-8mg/ml)のRNAに転写するこ とができます。例えば、T7 Kitの場合キット付属の1μgのコントロール用鋳型DNAを含 む20μlの反応液で2時間以内にほぼ150μgの1.4kbのRNAに転写することができます。 これは、鋳型DNA1分子当たり900回以上転写されたことになります。

RNA yield with AmpliScribe™ T7 Kitと他社の転写システムとのRNA合成量の比較

1.4Kb Contol Template DNA 1μg をAmpliScribe™ Kitを用いて 2時間、標準プロコール と他社のRNA転写システムの多量転写用プロトコールで比較しました。

長時間の反応では100%に近いNTPsが取り込まれ、200μgのRNA(10mg/ml)が理論上得ることができます。 AmpliScribe™ Kitでは、従来法では無理とされてきた200bases以下のRNA小断片を大量に転写することもできます。

Capped RNAは、AmpliScribe™反応中にGTPの一部をメチル化または非メチル化Cap analog(m7G[5']PPP[5']G or G[5']PPP[5']G)に代えることにより簡単に合成できます。合成量 はcapの無い反応に比べ少なくなりますが、従来法に対して数倍の合成量が得られます。

Ampliscribe Transcription Kitsは大量のRNA転写に適しています

• In vitro transcription
• Microinjection
• Anti-sense RNA
• RNA structural studies
• Ribozyme production
• Splicing and processing studies
• Isolation of RNA-binding proteins
• Gene expression studies
• Large-scale production of non-radioactive RNA probes
• Functional studies of heterogenous nuclear RNAs, tRNAs, viral RNAs and ribozymes
• Biopharmaceutical discovery

注意:高濃度のヌクレオシド三リン酸がRNAに取り込まれますので高比活性の放射性プロ ーブの合成には、通常適しません。

Figure 1. CAT ribozymeのRNA転写

転写反応は AmpliScribe kit のプロトコールで（5X standard reaction volume を100 μl使用を除いて)行われました。

テンプレートはHindIIIで直鎖化されたpGEMCAT2 (5 μg)。その後の処理は行わず、転写ミックスの一部を3% MetaPhorアガロースゲルにて電気泳動しました。

Lane M:

kb ladder DNA standards

lanes 1および5:

2 μgの50-nt DNAオリゴ

lanes 2-4:

それぞれ1 μl、2 μl、4 μlの転写ミックス

Figure 2. CAT RNAのribozyme cleavageの時間的経過

CAT基質RNAはTn9クロラムフェニコール アセチル トランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドのin vitro transcriptionにより得ました。

ribozymeのあるなしに関わらずleavageｎ　50 mM Tris-HCl、pH 7.5、5 mM MgCl2で行われました。 5 μlづつ時間間隔をおいて取り出し、同量のstop buffrerを含む8M ureaに加え3% MetaPhorゲルにて電気泳動します。

Figure 3. T7 control DNA templateとbiotin-UTPを使用したAmpliScribe反応物について

AmpliScribe反応はプロトコールに従って行った。しかしながらビオチン-UTPの濃度はテキストの記載どおり変化させた10、5、5

Lane 1:

kb DNA ladder

Lanes 2-4:

UTP (ビオチン-UTP無)RNA合成

Lanes 5-7:

1 mM ビオチン-UTP RNA合成

Lanes 8-10:

2.5 mM ビオチン-UTP RNA合成

Figure 4. ビオチン標識プローブを用いたコントロールDNAテンプレート量の減少

control DNA template の様々な量をメンブレンにブロッティングし、ハイブリダイゼーション後、biotinylated RNA probe20 ng/ml (synthesized using 2.5 mM biotin-UTP)を使用してケミカルルミネッセンス検出しました。

The quantity of target DNA was varied:

Lane 1:

100 pg

Lane 2:

50 pg

Lane 3:

10 pg

Lane 4:

5 pg

Lane 5:

1 pg

Figure 5. AmpliScribe Kitによるbiotin-labeled probeを使用してtarget DNAの特異的検出

5 pgのターゲットDNAを含む、μngのEcoRI切断済みバクテリア染色体DNAをメンブレン上にブロッティング、ハイブリダイゼーションし、ケミルミネッセンスによる検出を20 ng/mlのビオチンプローブ（2.5 mM biotin UTPを用いて合成）を用いて行いました。

Lane 1:

BstE II消化ビオチンλDNAマーカー（New England Biolabs）

Lane 2:

EcoRI消化バクテリア染色体DNA5 pgを含むターゲットDNA

Figure 6. 従来法とAmpliScribe反応のdegozigenin-cRNA Yieldの比較

従来法と比べ18倍のdig-cRNAを転写できました。

Kit Contents

• AmpliScribe Enzyme Solution (RNase inhibitor含有)
• 100mM ATP,CTP,GTP,UTP
• l0×AmpliScribe Reaction Buffer
• 0.1M Dithiothreitol(DTT)
• RNase-Free Water
• Control Template DNA
• RNase inhibitor-Free DNase I

保存温度：-20℃

• Cap Analogs
• T7,SP6,& T3 RNA Polymerases
• NTPs
• RiboScribe™ RNA Probe Synthesis Kits