Ampligase® Thermostable DNA Ligase

耐熱性リガーゼ

Epicentre社の開発したユニット定義により、Ampligase DNA Ligaseの1ユニットは少なくとも他社品が定義している"cohesive end units"、"nick closing units"の15ユニットに相当します。10μl反応量当り僅か0.1ユニットのAmpligase DNA Ligaseで十分な結合反応がおこなえます。

Ampligase® Thermostable DNA Ligaseは、高温で安定な2本鎖DNA構造で近接した3'-hydroxylatedと5'-phosphorylated末端のNAD依存性ligation反応を促します。耐熱性由来菌で高温安定性があり、65℃、48時間、または95℃、1時間以上でも1/2しか失活しません。

最低500回の熱サイクル反応(80℃/94℃)又は16時間のサイクリングで活性を示しました。一般的な上限の反応温度はDNA基質のTm値により決まります。

この高い熱安定性は高いバイブリダイゼイション強度をもたらし、非特異的結合を除きます。Ampligase DNA Ligaseは平滑末端の結合活性がなく、RNA基質RNA:DNAハイブリットに活性がありません。又、4べ一ス突出末端が安定な二本鎖を形成する温度、40℃で低い活性しかないのでT4 DNA Ligaseの代替にはなりません。

Application

結合物増幅

Nick Ligation AssayやLigase Chain Reaction(LCR)と呼ばれる結合物増幅には、標的配列に相補的な結合産物の幾何学的増幅により特定のDNA配列を検出する簡単かつ高感度な技法です。結合物増幅は僅か1シングルベースペアー違いのDNA配列を認識することができます。特定の配列(allelic classification)の検出と識別が必要とされる研究において、結合物増幅はPCRと比較して特異性と簡単さで有利です。例えば結合物増幅はヒト皮膚ガンに関わるヒトP53遺伝子の特異的変異の検出に用いられています。

Repeat Expansion Detection(RED)

REDは遺伝子的スクリーニングの結合−基本方法であり、トリヌクレオチド反復を増すことにより成り立つDNA領域を検出します。Ampligase® DNA Ligaseは、トリヌクレオチド反復がDNA鋳型にある場合にオリゴヌクレオチドマルチマーを産出する2段階の熱サイクル反応に用いられます。ヒト染色体において、コーディングや規定配列内でのこのような“反復増大"は遺伝的疾病の原因となります。

高忠実度遺伝子合成

Ampligase® DNA Ligaseは、相補的にオーバーラップする長い領域を含むオリゴヌクレオチドから高精度に遺伝子を合成するのに用いられます。例えばsutton et al.(Transgenic Reserch,vol.1pp.228-236.1992)よれば、29-79basesのoligosを用いてBacillus thurningiensis (BT)から1,800 basespairの修飾したDNAを合成しました。T4 DNA Ligaseを用いた以前の遺伝子合成の試みでは、不正確なオリゴ合成のクローンが多く生まれていましたが、Ampligase® DNA Ligaseを高温で遺伝子を合成することにより、少量のクローンをスクリーニングするだけで正確なシーケンスの遺伝子が合成できました。AmpligaseR DNA Ligaseによりスクリーニングとシーケンスの時間が短縮できます。

また、遺伝子コードの縮退を用いて原核細胞由来の遺伝子をより植物由来に近いものにしたり、操作しやすくするためにコドンを修正し、任意の制限酵素認識部位の導入をすることができました。プロモーター、CG-contentそしてコドンの使用頻度を変えることによりトランスジェニック植物において高い発現を得ることに成功しました。

Simultaneous Mutagenesis of Mutiple Sites

LCRとAmpligase® DNA Ligaseは特定部位で単一及び多数のpoint変異体を導入することに用いられます。変異プライマーにより導入されたpoint変異体をもったPCR-増幅DNA断片を結合することにより促進させられます。

高い強力な結合を必要とする用途

一般的に最適なAmpligase DNA Ligaseの反応温度は、複合物として残存するDNA基質の最も高いTm値になります。このような最高のバイブリダイゼイション強度をもたらす条件下では、非特異結合は極力排除されます。

Padlock Probes

この技術はDNA検出のため、スペーサー配列により接合した2つの標的-相補的端末配列をもつオリゴヌクレオチドを利用します。高温によるこの相補的標的に対するオリゴの特異的バイブリダイゼーションは、標的配列上オリゴ端末の並列をもたらします。オリゴ端末はAmpligase® DNA Ligaseの基質として役立ち、その結果結合は相同位置で閉環状プローブを形成します。Padlockプローブは最も過激な洗浄条件下でバイブリダイズが保持されるので、高い特異的標的検出が可能となります。Ampligase® DNA Ligaseの使用は又、シーケンスにおいて一本鎖ヌクレオチドにより、変更する対立形質間を識別する技法になります。

Figure 1.

Schematic of mutagenesis/amplification reaction and products. (Primers are designated by the solid arrows.) An interior mutagenic primer is incorporated into the final product by using a thermostable ligase. Two products are amplified: a full-length product which should contain the mutation of interest, and a smaller fragment resulting from extension from the mutagenic primer to the downstream primer.

Figure 2.

Ethidium bromide-stained 3% Nu-Sieve® agarose gel of mutagenesis/amplification reaction products. Lane 1, 1 kb marker DNA (only small fragments are resolved). Lane 2, normal amplification reaction using outer primers to generate 725 base-pair product. Lane 3, mutagenesis/ amplification reaction. Band A is the full-length wild-type product, band B is the deletion product produced by incorporation of the mutagenic primer, and band C is the truncated product produced by amplification between the mutagenic primer and the downstream primer.

Kit Contents

• Ampligase® DNA Ligase : 1,000U (Cat.No.A8101)or 5,000 U (Cat.No.A30201)
• Contorol DNA
• 10X Reaction Buffer : 2.5 ml

保存温度

-20℃

保存液組成

50mM Tris-HCl, pH7.5, 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1mM DTT, 50% glycerol

保存安定性

この酵素活性は、37℃、1週間上記測定反応液中のインキュベーションにおいて変化しません。

活性の定義

Sma IとSal Iで消化されたバクテリオファージλDNA 1μg中のcos siteを50%、45℃、1分間でligationする酵素量を1unitとする。

• T4 DNA Ligase
• T4 RNA Ligase
• T4 Polynucleotide Kinase