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アプリケーションノート

Microbiologics社標準菌株 FAQ

Q1. 培地性能試験を開始する1回目の試験の合格基準は?
A1. USPでは、「研究室における初回のテストに際してユーザーは、局方に記載されている検査方法について、その適正を検討する必要はありません。ただし、ユーザー側の実際の検査手順が局方の手順に沿って適切に行われていることを証明する文書を確立する事が望ましい。」と書かれています。この文書の確立について、Microbiologics社では、培地性能試験の適正を示すためのガイドを提供しています。このガイドは、ユーザーが局方の手順に則って適切に試験を行っていることを証明する手助けになります。 詳しくは下記URLのEZ-Accu Shot Verification Protocol もしくはEZ-CFU One Step Verification Guideをご覧ください。
https://www.brunschwig-ch.com/pdf/downloads/MI_EZAccuShotTIB281.pdf
https://www.brunschwig-ch.com/pdf/downloads/MI_EZCFUOneStepTIB290.pdf
Q2. ステアリン酸マグネシウムをJP3.4.1(ii)にならって試験したが、溶解せず分離します。推奨する方法はありますか?
A2. 水に不溶の非脂質製品は、被験製品をpH7.0のペプトン食塩緩衝液、pH7.2のリン酸緩衝液またはSCD培地に懸濁します。分散しやすくするために、界面活性剤を加えることができます(3.4.1試料の調整(ii) JP91ページより)。完全に溶解させることが難しい場合、可能な限り分散させてください。
Q3. 菌を起こしてグリセロールストックにした時の使用期限は?
A3. グリセロールストックで保存された懸濁液は、Microbiologics社のATCCRLDPライセンス製品のため複製・保存の規定に該当しますので保証の対象にはなりません。
Q4. 培地性能試験をする際にプレートを2枚以上使用する必要はありますか?
A4. 例えば(3.4.4.2 カンテン平板法JP91ページ)の適合性試験では、『各培地に対して少なくとも2枚の平均値を用いて実施』と記載があります。そのため培地性能試験においても 数値信頼性の観点より2枚以上の培地を用いて、平均値で判定することを推奨します。
Q5. (3.製品の試験 3.3サルモネラJP 95ページ) サルモネラ試験についてラパポート液体培地、XLD寒天培地で、どの時点で100CFUを確認すればよいか? XLD培地の他にTSI斜面培地で確認する必要はありますか?
A5. 培地性能試験は、培地がサルモネラを受け入れることができるかをテストするために使われます。適合性試験は、サルモネラを100CFU以下接種した時に、サルモネラが検出されるかどうかを確認するテストです。

培地性能試験について

もし培地性能試験を行う場合、以下のように行ってください。

  • ラパポート液体培地とXLD寒天培地において新バッチ及び有効性が確認されたバッチでサルモネラを100CFU以下で接種して試験を行ってください。(ラパポート液体培地にはS. aureusを用いて選択性試験も行ってください。)
  • 30-35℃で18時間以内でインキュベートします
  • 新バッチと有効性が確認されたバッチの増殖を比較し同等の発育を確認しなければなりません。
  • この時同じ微生物の懸濁液を使って、ラパポート液体培地、XLD培地と並行でソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地に接種することが望ましいです。これにより、どのぐらいのCFUが接種されたかを知ることができます。もし、ラパポート液体培地とXLDで増殖が得られず、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地で増殖するような場合には、培地に問題があるということになります。

適合性試験について

適合性試験を行うならば、以下を実行してください。

  • 製品の一部と、サルモネラ100CFU以下をSCD培地に接種して下さい。
  • 30-35℃で18時間培養して下さい。
  • 0.1mlをラパポート液体培地10mlに接種してください。
  • 18時間培養してください。
  • ラパポート液体培地をXLD培地に移植してください。
  • 18時間培養してください。
  • 黒いコロニー(サルモネラ)を探して下さい。もし黒いコロニーが見える時、サルモネラは、製品によって抑制されなかったことになります。
  • TSI斜面培地を用いた試験は、生薬の微生物限度試験法において必要です。非無菌製品の特定微生物試験では、TSI斜面培地を必ずしも使う必要はありません。

Q6. 培地性能試験に環境分離株を使用する必要性はどの程度でしょうか。
A6. 環境中の菌は製品に混入する可能性がありますので、環境分離株の試験は2つの試験法でテストしてください。
  1. 培地性能試験
    新しい培地バッチで菌が生育することを確認してください。
  2. 適合性試験
    製品を試験する時と同じ方法で、環境分離株が検出できるか試験する方法です。もし製品に抗菌剤を含んでいるなら、環境分離株を検出するため中和する必要があります。これは、抗菌剤が増殖を抑制する可能性があるためです。
  3. 環境分離株を使わなかった場合、FDAから警告の文書が出されることがあります。

Q7. 0.5MacFarlandで調製した時の菌量はどのくらいですか?どの程度の希釈段階を作る必要がありますか?
A7. McFarland標準液はチューブ中でおおよその菌量を測定するために用いられています。懸濁液0.5 McFarlandは約1.5X10E8CFU/mlです。それに適した濃度に希釈して下さい。

以下のリンクは、濁度系と分光光度計について議論されている記事です。

http://www.microbiol.org/resources/monographswhite-papers/measurement-of-cell-concentration-in-suspension-by-optical-density/

McFarland標準液はBDマニュアルp352(インターネットFree)に記述されています。

http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf

1X10E8CFU/mlでは、数が多くGPTを行うことができません。新たなコロニーを100CFU以下で接種できるように、何度か希釈する必要性があります。 分光光度計や濁度系を使うことによって、P. aeruginosa のような細菌の濃度を計測することができます。100CFU以下の接種を得るためには、いくつかの希釈液を作る必要があります。下記のリンクを参照ください。

http://www.microbiol.org/resources/monographswhite-papers/measurement-of-cell-concentration-in-suspension-by-optical-density/

Q8. 粉末培地を1か月毎に調整して培地性能試験をしているが、旧バッチと新バッチはどうやって比較すればよいのでしょうか?(旧バッチ培地は1か月 保管できないので新バッチ培地と1/2〜2倍の比較ができない。)
A8. 前回承認した培地がなければ、過去のデータを使用することができます。過去のデータとは、前回承認した培地をテストしたときに、紙やパソコンに記録したコロニー数のことです。新しいバッチで回収したコロニー数と、前回承認した培地のコロニー数を比較する必要があります。
Q9. 特定微生物試験で黄色ブドウ球菌試験のE.coli選択特性を確認する際、マンニット食塩カンテン培地でコロニーがでない事を確認する必要があるが、その際のPositiveコントロール試験でSCDAを用いて100CFU以上を確認しないといけないのか?その際の培地はSCDAでないといけないのか?(代用としてマッコンキーカンテン培地は使用できないのか?)
A9. 接種したCFU数を知るための最適な方法は、非選択寒天培地を使うことです。マンニット食塩カンテン培地やマッコンキー寒天培地は選択培地です。選択培地は増殖する菌も抑制します。S. aureusは、 マンニット食塩カンテン培地のような選択培地よりも、SCDAのような非選択培地でより増殖します。非選択培地上でのコロニー数は、接種した本来のCFU数を示す最適な方法です。The Difco and BDマニュアルでは、『選択培地中の成分は、本来生育すべき菌に対しても生育を抑制することがあります。これはサンプル中に多くの菌が存在する場合に顕著です。選択培地を使用したい場合は、非選択培地と比較培養して追加の情報を得ることが望ましい。』と記載されています。
Q10. P. areruginosaを用いて、セトリミド寒天培地に接種した時、増殖しやすい時とそうでない時があるがどうしてでしょうか?
A10. セトリミド寒天培地は、非常に選択性の高い培地です。これは、本来生育すべき菌も抑制する場合がありますので、P. areruginosaは新鮮なものを使用して下さい。 他の培地と同様、多くの菌量を接種した時にはCFU数も増える傾向にありますが、以下の3点に注意を払う必要があります。
  • ピペッティング・・・ピペッティングの操作の差は、培地に接種される菌量に影響します
  • 寒天培地・・・培地のメーカー、ロットなどにより、それぞれの寒天培地には差があります。
  • 接種する菌の濃度  

    セトリミド寒天培地を使用する場合には、並行して非選択培地を使用し正しいCFU数を決定することを推奨致します。

Q11. R2A培地性能試験の合否基準について、十分な発育量の定義を教えてほしい。50〜200CFUの範囲でいいのでしょうか?
A11. 量的な定義はありませんが、50〜200CFUの間が望ましいとされています。
Q12. 代表菌選定の質問がありましたが、回答をもらえることは可能でしょうか
A12. 現在情報をまとめています。
Q13. Enterococcus faecalisをメンブレンフィルター法で栄養培地を用いて培養した際に、塗抹法やSCDAを用いた場合に比べCFU数が減るのはどうしてですか?(セミナー資料P41より)
A13. Microbiologics社ではメンブレンフィルター法においてテストされた種のCFU数が低かった理由については特定していません。
Q14. 培地を調製する際、乾燥時間の設定の推奨時間を教えてほしいです(セミナー資料P48, ベストプラクティスより)。また、嫌気性細菌用の培地の場合を作製する際に、8-12時間の乾燥が必要ですか。
A14. 培地を乾燥させることは重要です。以下にあげるように様々な乾燥方法があり、乾燥時間は方法に依存します。8−12時間、プレートを乾燥させる時間がない場合や嫌気性用の培地を調整する場合に、以下の方法をお勧めします。
  • 自動スパイラルプレーターのユーザーガイドでは『最適なパフォーマンスのため使用前に冷蔵していたプレートをひっくり返し、室温で48時間またはラミナーフローフードの中で15分間乾燥させる』事をお勧めしています。
  • CLSIスタンダードの「Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests」では『使用前、プレートの表面に蒸気がある場合、インキュベータ(35℃)またはラミナーフローフード(室温)に蒸気がなくなるまで(通常10−30分)入れてください。また植菌した際、培地の表面やペトリディッシュの蓋に滴がある状態は良くありません』と記載されています。
  • ISO 11133-1 『Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs - Guidelines on Preparation and Production of Culture Media』では『一般的には、蓋をとり寒天培地の表面をできればラミナーフローキャビネット内で培地表面を逆さにして25℃〜50℃にて培地表面の滴が消えるまで乾燥させます(ただし過度の乾燥にご注意ください)』と記載されています。
  • The Difco and BD Manualでは『冷蔵保存された調整済み培地を冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。植菌前に結露を蒸発させるか、もしくは消散させ、温度差がある状態を避けてください』と記載されています。
  • The USP Chapter 61 Microbial Enumeration Testsでは、『例えば、ラミナーフローキャビネット もしくはインキュベータ内でプレートを乾燥してください』と記載されています。
Q15. 「カンテン培地を溶解し、3時間以上溶融状態にしないでください」とありますが、溶融状態での時間経過による培地性能試験への影響はなんですか?(セミナー資料P51より)
A15. Oxoidマニュアルの8th 版によると、『過熱によりpHの変動、培地の色が暗くなる、沈殿、ゲル強度の低下、微生物への効果減少などがあげられます。これらは、容器の底で成分が過熱された場合に起こる場合があります。すべての培地は滅菌前、溶液の状態でなければなりません。これにより培地中で起こるメイラード反応の発生を抑えられます。過熱の影響は、寒天培地がボトル中でゲル化したものを再度蒸気で過熱し、溶解させた際に出てくることがあります。また培地を使用する前に50℃で3時間以上置いた場合、影響が生じる場合があります。』
Q16. 環境菌の選択方法について具体的に教えてほしい。(例えばP. aeruginosaと他菌が環境菌として検出された場合、局方ではP. aeruginosaのATCC9027株は試験されているので他菌を優先すべきか?)FDA査察時は環境菌についてどのような質問があるのか教えてほしい。環境菌を自社ストックする必要性はありますか?
A16. 環境分離菌テストの必要性があるかどうかを決定するために、リスク評価を実行しなければなりません。リスク評価では、以下の問題を考慮しなければなりません。
  • この微生物は消費者に有害になることがありますか?
  • 消費者に年配者、幼児、免疫障害を持つ方はいますか?
  • 製品はどのように用いられますか?(例えば、皮膚に使用、口腔内で使用、等々)
  • 環境分離菌は、製品に変化を及ぼしますか? (pHの変化、ガスや異臭を産生する、等々)

凍結乾燥した分離株は、冷凍庫で保存しているよりも良い状態で保温できます。その理由として、

  • 見つかった状況に近い状態で、分離菌を維持します。
  • 必要な時にいつでも微生物を利用することができます。
  • コンタミを防止します。
  • 微生物を生存状態で保存します。
  • 継代培養の繰り返しによる突然変異を避けます。

FDAが尋ねる質問は、監査官によって左右されます。彼らが何を訪ねるかは、FDA警告書を調べることができます。年ごとのレターをチェックすることができます。以下は2014年のものです。

http://www.fda.gov/ICECI/EnforcementActions/WarningLetters/2014/default.htm

Q17. SCD液体培地の性能試験では、どれほどの培地量に対してどれほどの接種菌が適当なのでしょうか。(濁りが確認できれば良いということで、その加減は個人の裁量によるものなのか。)
A17. 日本薬局方ではどのくらいの培地量を試験に使用するか規定されていません。 濁度に関しては日本薬局方では「液体培地では、有効性が確認された培地バッチで以前に得られた発育と同等の発育が認められなければならない。」(p90)とあり、「同等」の量的定義はJPでは規定されていません。目視(Visually growth)の同等性で十分です。 またMicrobiologics社のアドバイスとしてコロニー成育と正確な微生物かどうか確かめるために寒天培地に液体培地の一部を塗布することも良いかもしれません。
Q18. セミナーのテキストではSCD液体培地の試験菌は、寒天培地と同じ5菌種を用いるとあるが、日局では3菌種で記載されているように思われます。ご確認をお願いしたいです。
A18. 日本薬局方の生菌数試験の液体培地(SCD broth)では左表の3種の菌株を使用します。日本薬局方の生菌数試験のカンテン培地では表の5種の菌株を使用します。

生菌数試験のカンテン培地

Q19. 性能試験において、大腸菌はSCD液体培地の接種菌に含まれていませんが、実際の製剤の試験で特定菌試験の大腸菌試験を実施する際、SCD液体培地で新鮮培養した後にマッコンキー液体培地等を用いる手順となっています。 国際調和以前は大腸菌もSCD液体培地の性能試験で接種菌に含まれていたと思いますが、現在の手法では厳密に言うと大腸菌が生える性能は確認していないように思われるのですが、このことに対しての一般的な考え方を教えていただきたいです。(国際調和の手法であるため今の5菌種で納得するしかないのでしょうか?)
A19. 培地性能試験・生菌数試験では5種以上の試験菌を使用することもできます。もしご希望であればE.coliも加えていただくことも可能です。 また、お問い合わせいただいたように製品試験においてのE.coli試験の場合、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地、マッコンキー液体培地、マッコンキーカンテン培地で集落が存在しないか同定試験で陰性と判定された場合、E.coli陰性に適合します。

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