ダウンロード

  • カタログダウンロード
  • epicentreプロトコールダウンロード
  • アプリケーションノート
  • 製品動画はこちら
  • 03-3545-5720(東京)
  • 06-6282-4004(大阪)
お問い合わせはこちら

アプリケーションノート

MessageBOOSTER

MessageBOOSTER を用いることで、ごく少量の細胞(1細胞)からcDNAの合成からリアルタイムPCRの解析が可能です。リアルタイムPCR法を用いての遺伝子発現解析は、頻繁に使用されます。

MessageBOOSTER は、1〜50細胞(10〜500pg)からリアルタイムPCR解析を可能にします。トータルRNA中のPoly(A)を持つmRNAを増幅し、リアルタイムPCRに使用可能なcDNAに変換します。

簡単な原理は以下の様になります。

  • Poly(A)を持つRNAを、逆転写酵素とT7-Oligo(dT)プロモータープライマーにより、一本鎖cDNAを作製
  • 二本鎖cDNAを合成(RNaseHによりRNAは分解)
  • AmpliScribe T7を使ってRNAを合成(スピンカラムを使ってRNAの精製)
  • 逆転写酵素によってRNAを逆転写、一本鎖cDNAの合成
  • リアルタイムPCR

リアルタイムPCRに使用可能なcDNAに変換

実験例

ラットの腎臓細胞(NRK)を使って、10pgのトータルRNAを抽出した。Epicentre社のMasterPure RNA Purification Kitを使用してRNAを抽出し、逆転写はSuperScript 靴函T7 RNAポリメラーゼoligo(dT)プロモータープライマーで、50℃で30分間処理した。cDNAとRNAのハイブリッドはRNase Hによって65℃で10分間処理され、second-strand cDNAは作製された。アンチセンスなRNA(aRNA、cRNA)はT7 transcriptionにより42℃、4時間で作製された。In vitroの逆転写反応は、DNase 処理をして、aRNAはスピンカラムによって回収された。回収されたaRNAはMMLV Reverse Transcriptaseとランダムヘキサマープライマーによって室温で10分、その後、37℃、60分間処理した。RNase H処理をした一本鎖DNAを用いてリアルタイムPCRを行った。最終的なcDNA合成反応は、約7μlであった。RNA 10pg→cDNA 7μlを合成。1μlのcDNAは、約25μl PCRの系で1μl使用された。

結果

以下3つの発現を確認しました。

  • Porphobilinogen Deaminase (PBGD:発現量:低)
  • Pre-B-cell leukemia transcription factor 2 (PBX2:発現量:中)
  • beta-2-microglobulin (B2M:発現量:高)

下図:MessageBOOSTERを用いてトータルRNA 10pgからcDNAを合成しリアルタイムPCRを行いました。

  • A:PBGD(発現:低)
  • B:PBX2(発現量:中)
  • C:B2M(発現量:高)

FIG1

MessageBOOSTERを用いて、リアルタイムPCRが行える回数です。

リアルタイムPCRが行える回数

  • 10pgのRNAを回収し、発現が低い細胞であれば10回以上。
  • 100pgのRNAを回収し、発現が高い細胞であれば100回以上。

このようにMessageBOOSTERを用いることで、 1細胞からmRNA増幅しPCRやリアルタイムPCRに使用できます。

Q1. MessageBOOSTER Kitは、リアルタイムPCR用に作られているのですか?
A1. MessageBOOSTER Kitは、転写効率の低い産物でさえ、cDNAを十分量産生することができます。1〜50細胞(10-500pg)のトータルRNAからリアルタイムPCRが行えます。
MessageBOOSTERの増幅は、全体の遺伝子発現プロファイルが保存されているという点が重要です。1細胞からトータルRNAで開始は、10回までリアルタイムPCRを行うだけ産生することができます。
Q2. MessageBOOSTER cDNA合成キットはどのような原理ですか?
A2. 最初に、トータルRNAサンプル中のpoly(A) RNAは、''Eberwine''のT7直鎖RNA増幅法を調整、改変したものを使用して、アンチセンスRNAを産生します。合成されてアンチセンスRNAは、スピンカラムで精製され、次にEpicentre社のMMLV(Moloney Murine Leukemia Virus)逆転写酵素Plus(MMLV-RT Plus)でランダムプライマーを使用しています。これは、cDNAの大部分を正確に高品質な状態で作成することができます。cDNAはリアルタイムPCR(SYBR Greenやfluorescent probe)で使用することができます。
Q3. 以前にMessageBOOSTER Kitを用いて合成したcDNAがあるのですが、リアルタイムPCRにどのぐらい使えばよいでしょうか?
A3. MessageBOOSTERによって作られたcDNAは、最終5.5μlになります。リアルタイムPCRに使用するcDNAの総量は、MessageBOOSTERの使用したスタートのトータルRNA量が必要です。また経験的な部分も必要になります。例えば、トータルRNA量10pgで開始した場合、低・中発現の転写物であれば、MessageBOOSTER反応に1μlを使用します。高発現であれば、10倍希釈して1μlを使用します。
Q4. MessageBOOSTER cDNA合成キットを使用して最適な結果を得るために、重要なことは何でしょうか?
A4. 貴重なサンプルを使う前に、コントロールで実験を何度か行って慣れて下さい。トータルRNAの500pg程度を使って、RNAの増幅がインプットしたRNAの性質によって影響を受けることを覚えていて下さい。
Q5. MessageBOOSTER反応によって合成されたcDNAを使用する時、リアルタイムPCR用のプライマーのデザインはどのようにすればよいでしょうか?
A5. 増幅したRNAは、cDNAを作製するために、3'側にバイアスがかかっています。リアルタイムPCRを最適にするために、選択するプライマーは、mRNAの3'側の500ベース以内で作成することをお勧めします。mRNAの3’側から500ベース以上では感受性が減少するかもしれません。
Q6. 二回目のcDNA反応で、wildタイプのMMLV-RTを用いて、さらにRNase Hを使っています。これはどうしてでしょうか?WildタイプのMMLVはRNase H活性を持っていないのでしょうか?
A6. Epicentre社のMMLV-RT PlusはRNase H活性を持っています。逆転写酵素反応の後、RNase Hを加えることで、RNA:DNAハイブリッドからRNAの除去を促進することが証明されています。
Q7. MessageBOOSTER反応で合成されたcDNAはRNase H処理の後、追加で精製する必要がありますか?
A7. いいえ、cDNAはリアルタイムPCR反応のテンプレートとして直接使用することができます。
Q8. FirstラウンドのcDNA合成を行う際に、どうして違う会社の逆転写酵素を使用しなければならないのでしょうか?
A8. スタンダードMMLV RT酵素(一般的なcDNA合成反応でcDNAを作るために使用します)は、少ない量のインプット量では検出することが難しいことが知られています。最初のcDNA合成でSuperscript掘Invitrogen)を使用するステップは、少ない量、特に1ng以下のRNAサンプル転写物の検出を促進することが知られています。この酵素を使用することでMessageBOOSTERは少量のサンプル量で使用することが可能となっています。
Q9. MessageBOOSTERを使って合成したcDNAはNext-Generation Sequencing(NGS)反応に使用することができますか?
A9. はい。single-stranded cDNAは、double-stranded cDNAに変換でき、NGSアプリケーションに使用するためのライブラリーを作製することができます。second cDNA合成ステップは、例えばScriptSeq mRNA-Seq kitを使うことで、省略できる場合もあります。MessageBOOSTER反応と精製の後、アンチセンスRNAは、Qubit/Fluorimeterで計測して、アンチセンスRNAが十分存在していることを確認して下さい。mRNAの増幅によってアンチセンスRNAを合成しているので、rRNAの除去は必要ありません。シーケンスライブラリーは、その時にスタンダードな技術を使うことで作製可能です。完了したシーケンスは、増幅したRNAとオリジナルのRNAサンプルとで比較して下さい。

PAGE TOP