アプリケーションノート
MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit
MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kitは、様々なサンプルからDNA/RNAを精製するキットです。
塩沈殿プロトコールにより様々な試料から高純度の核酸を精製できます。精製した全核酸(TNA)、DNA、RNAはPCR、RT-PCR、クローニング、DNAシーケンス、ノーザン・サザンブロッティング、制限酵素処理、ゲノムライブラリー調整用など様々なアプリケーションに直接使用できます。
このKit一つで、全核酸(TNA)、DNA、RNAの抽出を行うことができます。
特徴
- カラム法に比べると高収量
- TNA, DNA, RNAの選択可能
- 迅速に抽出:TNA(30分)、DNA(45分)、RNA(60分)
MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kitプロトコール (英語版はこちら→英語プロトコール)
Kit内容
- Red Cell Lysis Solution
- Tissue and Cell Lysis Solution
- 2X T and C Lysis Solution
- MPC Protein Precipitation Reagent
- RNase A (5 mg/ml)
- RNase-Free DNase I (1 U/μl)
- Proteinase K (50 μg/μl)
- RiboGuard™ RNase Inhibitor(40 U/μl)
- 1X DNase Buffer
- TE Buffer
プロトコールはTNA、DNA、RNA抽出の3つから選択することができます。
さらにサンプルごと(液体、細胞、組織、全血、FFPE)にプロトコールがあります。下記をご覧下さい。
TNA 全核酸(Total Nucleic Acids)精製プロトコール
液体サンプルの場合(唾、精液)
- サンプルを収集後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
- 2X T and C Lysis Solution 150 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 液体サンプル150μlをチューブに移し、2で作製した(2X T and C Lysis Solution+Proteinase K)と混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
細胞サンプルの場合(哺乳類培養細胞、口腔細胞、E.coli)
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 遠心によって細胞(哺乳類の培養細胞では0.5〜1 x 10E6、E.coliの場合0.1-0.5mlを一晩培養)をペレット状にする。約25μl溶液を残し、上清を取り除く。
- 10秒間ボルテックスを行い細胞をほぐす。
- 1で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
組織サンプルの場合(植物や動物組織)
- 組織サンプル1-5 mgを回収後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 新鮮な組織をホモジェナイズもしくは凍結組織を磨り潰し、チューブへ移す。
- 2で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
全血の場合(赤血球溶解)
- 採血(EDTA Vacutainer® tube等で)。200 μlをチューブに移す。
- Red Cell Lysis Solutionを600 μl加えて、3回反転させ混合し、チューブをタッピング
- 室温で5分間インキュベートし、軽くボルテックス。続けて室温に5分置いて、再度軽くボルテックス。
- 遠心25秒間行い、白血球をペレット化させる。
- 約25μl溶液を残し、上清を取り除く。ボルテックスにより細胞をほぐす。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300μlを白血球に加えて数回ピペッティング。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
- クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
- 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
- 3で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
注意:(キシレンやヘモディーを使用の場合)
- クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
- 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
- 1-5mlのキシレンまたはヘモディーをパラフィン除去のために加えて、室温で10分インキュベート。溶媒を流す。
- 3のステップを繰り返す。
- 1-5mlの100%エタノールを加えて、室温で10分インキュベート。エタノールを流す。
- 5のステップを繰り返す。
- 残りのエタノールをすべてアスピレート。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
- 8で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)
- 上記サンプル300 μl にMPC Protein Precipitation Reagentを150 μl 加えてボルテックス10秒。
- 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行う。もしペレットが少量やロスしていた場合、MPC Protein Precipitation Reagentを25μl混ぜて、再度ペレット化する。
- 上清を新しいチューブへ移す。
- イソプロパノール500 μlを回収した上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
- 4°Cで10分間遠心し核酸をペレット化させる。
- イソプロパノールを除去してください。ペレットが失くならないように注意して下さい。
- 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
- TE Bufferを35 μl加えて溶解して下さい。
DNA DNA精製プロトコール
※Total Nucleic Acids精製プロトコールと基本的には同じだが、途中RNaseAを加えることになる。
液体サンプルの場合(唾、精液)
- サンプルを収集後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
- 2X T and C Lysis Solution 150 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 液体サンプル150μlをチューブに移し、2で作製した(2X T and C Lysis Solution+Proteinase K)と混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
- 37°C、30分インキュベート。
- 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
細胞サンプルの場合(哺乳類培養細胞、口腔細胞、E.coli)
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 遠心によって細胞(哺乳類の培養細胞では0.5~1 x 10E6、E.coliの場合0.1-0.5mlを一晩培養)をペレット状にする。約25μl溶液を残し、上清を取り除く。
- 10秒間ボルテックスを行い細胞をほぐす。
- 1で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
- 37°C、30分インキュベート。
- 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
組織サンプルの場合(植物や動物組織)
- 組織サンプル1-5 mgを回収後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 新鮮な組織をホモジェナイズもしくは凍結組織を磨り潰し、チューブへ移す。
- 2で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
- 37°C、30分インキュベート。
- 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
全血の場合(赤血球溶解)
- 採血(EDTA Vacutainer® tube等で)。200 μlをチューブに移す。
- Red Cell Lysis Solutionを600 μl加えて、3回反転させ混合し、チューブをタッピング
- 室温で5分間インキュベートし、軽くボルテックス。続けて室温に5分置いて、再度軽くボルテックス。
- 遠心25秒間行い、白血球をペレット化させる。
- 約25μl溶液を残し、上清を取り除く。ボルテックスにより細胞をほぐす。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300μlを白血球に加えて数回ピペッティング。
- RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
- 37°C、30分インキュベート。
- 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
- クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
- 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
- 3で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
- 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
- 37°C、30分インキュベート。
- 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
注意:(キシレンやヘモディーを使用の場合)
- クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
- 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
- 1-5mlのキシレンまたはヘモディーをパラフィン除去のために加えて、室温で10分インキュベート。溶媒を流す。
- 3のステップを繰り返す。
- 1-5mlの100%エタノールを加えて、室温で10分インキュベート。エタノールを流す。
- 5のステップを繰り返す。
- 残りのエタノールをすべてアスピレート。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
- 8で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
- 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
- 37°C、30分インキュベート。
- 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。
DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)
- 上記サンプル300 μl にMPC Protein Precipitation Reagentを150 μl 加えてボルテックス10秒。
- 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行う。もしペレットが少量やロスしていた場合、MPC Protein Precipitation Reagentを25μl混ぜて、再度ペレット化する。
- 上清を新しいチューブへ移す。
- イソプロパノール500 μlを回収した上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
- 4°Cで10分間遠心し核酸をペレット化させる。
- イソプロパノールを除去してください。ペレットが失くならないように注意して下さい。
- 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
- TE Bufferを35 μl加えてDNAを溶解して下さい。
RNA RNA精製プロトコール
※Total Nucleic Acids精製プロトコールと同じ。Total Nucleic Acidsを回収後、DNase Iを添加する。
液体サンプルの場合(唾、精液)
- サンプルを収集後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
- 2X T and C Lysis Solution 150 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 液体サンプル150μlをチューブに移し、2で作製した(2X T and C Lysis Solution+Proteinase K)と混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。
細胞サンプルの場合(哺乳類培養細胞、口腔細胞、E.coli)
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 遠心によって細胞(哺乳類の培養細胞では0.5~1 x 10E6、E.coliの場合0.1-0.5mlを一晩培養)をペレット状にする。約25μl溶液を残し、上清を取り除く。
- 10秒間ボルテックスを行い細胞をほぐす。
- 1で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。
組織サンプルの場合(植物や動物組織)
- 組織サンプル1-5 mgを回収後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
- 新鮮な組織をホモジェナイズもしくは凍結組織を磨り潰し、チューブへ移す。
- 2で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。
全血の場合(赤血球溶解)
- 採血(EDTA Vacutainer® tube等で)。200 μlをチューブに移す。
- Red Cell Lysis Solutionを600 μl加えて、3回反転させ混合し、チューブをタッピング
- 室温で5分間インキュベートし、軽くボルテックス。続けて室温に5分置いて、再度軽くボルテックス。
- 遠心25秒間行い、白血球をペレット化させる。
- 約25μl溶液を残し、上清を取り除く。ボルテックスにより細胞をほぐす。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300μlを白血球に加えて数回ピペッティング。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。
ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
- クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
- 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
- 3で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。
ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
注意:(キシレンやヘモディーを使用の場合)
- クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
- 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
- 1-5mlのキシレンまたはヘモディーをパラフィン除去のために加えて、室温で10分インキュベート。溶媒を流す。
- 3のステップを繰り返す。
- 1-5mlの100%エタノールを加えて、室温で10分インキュベート。エタノールを流す。
- 5のステップを繰り返す。
- 残りのエタノールをすべてアスピレート。
- Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
- 8で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
- 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
- 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。
Total Nucleic Acidsの回収&Total Nucleic AcidsからDNAの除去
- 上記サンプル300 μl にMPC Protein Precipitation Reagentを150 μl 加えてボルテックス10秒。
- 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行う。もしペレットが少量やロスしていた場合、MPC Protein Precipitation Reagentを25μl混ぜて、再度ペレット化する。
- 上清を新しいチューブへ移す。
- イソプロパノール500 μlを回収した上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
- 4°Cで10分間遠心し核酸をペレット化させる。
- イソプロパノールを除去してください。ペレットが失くならないように注意して下さい。
- 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
- TE Bufferを35 μl加えて溶解して下さい。
※以下、DNA除去プロトコール
- ピペットでイソプロパノールを完全に除去する。Remove all of the residual isopropanol with a pipet.
- 1X DNase Buffer200μlにRNase-Free DNase Iを 5 μl 加えて、DNase I solutionを準備する。
- DNase I solution 200 μlを加えて total nucleic acidのペレットを完全に溶解する。
- 37°C、10分インキュベート(DNAを完全に取り除くために最大で30分のインキュベート)。
- 2X T and C Lysis Solutionを200 μl 加えて、5秒間ボルテックス。
- MPC Protein Precipitation Reagentを200μl加えて、10秒間ボルテックス。3-5分間氷上へ。
- 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行い、ペレット化させる。
- RNAを含む上清を新しいチューブへ移す。
- イソプロパノール500μlを加えて、上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
- 4°Cで10分間遠心しRNAをペレット化させる。
- イソプロパノールを除去してください。ペRNAのペレットが失くならないように注意して下さい。
- 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
- TE Bufferを10-35 μl加えて溶解して下さい。
- (オプション) RiboGuard™ RNase Inhibitor を1 μl 加えて下さい。