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アプリケーションノート

MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kit

MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kitは、様々なサンプルからDNA/RNAを精製するキットです。

塩沈殿プロトコールにより様々な試料から高純度の核酸を精製できます。精製した全核酸(TNA)、DNA、RNAはPCR、RT-PCR、クローニング、DNAシーケンス、ノーザン・サザンブロッティング、制限酵素処理、ゲノムライブラリー調整用など様々なアプリケーションに直接使用できます。

このKit一つで、全核酸(TNA)、DNA、RNAの抽出を行うことができます。

特徴

  • カラム法に比べると高収量
  • TNA, DNA, RNAの選択可能
  • 迅速に抽出:TNA(30分)、DNA(45分)、RNA(60分)

DNA、RNAの抽出

MasterPure™ Complete DNA and RNA Purification Kitプロトコール (英語版はこちら→英語プロトコール

Kit内容

  • Red Cell Lysis Solution
  • Tissue and Cell Lysis Solution
  • 2X T and C Lysis Solution
  • MPC Protein Precipitation Reagent
  • RNase A (5 mg/ml)
  • RNase-Free DNase I (1 U/μl)
  • Proteinase K (50 μg/μl)
  • RiboGuard™ RNase Inhibitor(40 U/μl)
  • 1X DNase Buffer
  • TE Buffer

プロトコールはTNA、DNA、RNA抽出の3つから選択することができます。

さらにサンプルごと(液体、細胞、組織、全血、FFPE)にプロトコールがあります。下記をご覧下さい。

TNA 全核酸(Total Nucleic Acids)精製プロトコール

液体サンプルの場合(唾、精液)

  1. サンプルを収集後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
  2. 2X T and C Lysis Solution 150 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  3. 液体サンプル150μlをチューブに移し、2で作製した(2X T and C Lysis Solution+Proteinase K)と混合する。
  4. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  5. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

細胞サンプルの場合(哺乳類培養細胞、口腔細胞、E.coli)

  1. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  2. 遠心によって細胞(哺乳類の培養細胞では0.5〜1 x 10E6、E.coliの場合0.1-0.5mlを一晩培養)をペレット状にする。約25μl溶液を残し、上清を取り除く。
  3. 10秒間ボルテックスを行い細胞をほぐす。
  4. 1で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  6. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

組織サンプルの場合(植物や動物組織)

  1. 組織サンプル1-5 mgを回収後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
  2. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  3. 新鮮な組織をホモジェナイズもしくは凍結組織を磨り潰し、チューブへ移す。
  4. 2で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  6. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

全血の場合(赤血球溶解)

  1. 採血(EDTA Vacutainer® tube等で)。200 μlをチューブに移す。
  2. Red Cell Lysis Solutionを600 μl加えて、3回反転させ混合し、チューブをタッピング
  3. 室温で5分間インキュベートし、軽くボルテックス。続けて室温に5分置いて、再度軽くボルテックス。
  4. 遠心25秒間行い、白血球をペレット化させる。
  5. 約25μl溶液を残し、上清を取り除く。ボルテックスにより細胞をほぐす。
  6. Tissue and Cell Lysis Solution 300μlを白血球に加えて数回ピペッティング。
  7. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合

  1. クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
  2. 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
  3. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
  4. 3で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
  6. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合  
注意:(キシレンやヘモディーを使用の場合)

  1. クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
  2. 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
  3. 1-5mlのキシレンまたはヘモディーをパラフィン除去のために加えて、室温で10分インキュベート。溶媒を流す。
  4. 3のステップを繰り返す。
  5. 1-5mlの100%エタノールを加えて、室温で10分インキュベート。エタノールを流す。
  6. 5のステップを繰り返す。
  7. 残りのエタノールをすべてアスピレート。
  8. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
  9. 8で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  10. 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
  11. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール)

  1. 上記サンプル300 μl にMPC Protein Precipitation Reagentを150 μl 加えてボルテックス10秒。
  2. 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行う。もしペレットが少量やロスしていた場合、MPC Protein Precipitation Reagentを25μl混ぜて、再度ペレット化する。
  3. 上清を新しいチューブへ移す。
  4. イソプロパノール500 μlを回収した上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
  5. 4°Cで10分間遠心し核酸をペレット化させる。
  6. イソプロパノールを除去してください。ペレットが失くならないように注意して下さい。
  7. 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
  8. TE Bufferを35 μl加えて溶解して下さい。

DNA DNA精製プロトコール

※Total Nucleic Acids精製プロトコールと基本的には同じだが、途中RNaseAを加えることになる。

液体サンプルの場合(唾、精液)

  1. サンプルを収集後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
  2. 2X T and C Lysis Solution 150 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  3. 液体サンプル150μlをチューブに移し、2で作製した(2X T and C Lysis Solution+Proteinase K)と混合する。
  4. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  5. 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
  6. 37°C、30分インキュベート。
  7. 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

細胞サンプルの場合(哺乳類培養細胞、口腔細胞、E.coli)

  1. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  2. 遠心によって細胞(哺乳類の培養細胞では0.5~1 x 10E6、E.coliの場合0.1-0.5mlを一晩培養)をペレット状にする。約25μl溶液を残し、上清を取り除く。
  3. 10秒間ボルテックスを行い細胞をほぐす。
  4. 1で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  6. 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
  7. 37°C、30分インキュベート。
  8. 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

組織サンプルの場合(植物や動物組織)

  1. 組織サンプル1-5 mgを回収後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
  2. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  3. 新鮮な組織をホモジェナイズもしくは凍結組織を磨り潰し、チューブへ移す。
  4. 2で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  6. 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
  7. 37°C、30分インキュベート。
  8. 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

全血の場合(赤血球溶解)

  1. 採血(EDTA Vacutainer® tube等で)。200 μlをチューブに移す。
  2. Red Cell Lysis Solutionを600 μl加えて、3回反転させ混合し、チューブをタッピング
  3. 室温で5分間インキュベートし、軽くボルテックス。続けて室温に5分置いて、再度軽くボルテックス。
  4. 遠心25秒間行い、白血球をペレット化させる。
  5. 約25μl溶液を残し、上清を取り除く。ボルテックスにより細胞をほぐす。
  6. Tissue and Cell Lysis Solution 300μlを白血球に加えて数回ピペッティング。
  7. RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
  8. 37°C、30分インキュベート。
  9. 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合

  1. クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
  2. 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
  3. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
  4. 3で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
  6. 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
  7. 37°C、30分インキュベート。
  8. 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合
注意:(キシレンやヘモディーを使用の場合)

  1. クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
  2. 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
  3. 1-5mlのキシレンまたはヘモディーをパラフィン除去のために加えて、室温で10分インキュベート。溶媒を流す。
  4. 3のステップを繰り返す。
  5. 1-5mlの100%エタノールを加えて、室温で10分インキュベート。エタノールを流す。
  6. 5のステップを繰り返す。
  7. 残りのエタノールをすべてアスピレート。
  8. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
  9. 8で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  10. 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
  11. 37°C にして、RNase A(5 μg/μl )を1 μl 加える。よく混ぜる。
  12. 37°C、30分インキュベート。
  13. 氷上に3〜5分置いて、下記DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)へ。

DNAの回収(核酸沈殿プロトコール)

  1. 上記サンプル300 μl にMPC Protein Precipitation Reagentを150 μl 加えてボルテックス10秒。
  2. 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行う。もしペレットが少量やロスしていた場合、MPC Protein Precipitation Reagentを25μl混ぜて、再度ペレット化する。
  3. 上清を新しいチューブへ移す。
  4. イソプロパノール500 μlを回収した上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
  5. 4°Cで10分間遠心し核酸をペレット化させる。
  6. イソプロパノールを除去してください。ペレットが失くならないように注意して下さい。
  7. 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
  8. TE Bufferを35 μl加えてDNAを溶解して下さい。

RNA RNA精製プロトコール

※Total Nucleic Acids精製プロトコールと同じ。Total Nucleic Acidsを回収後、DNase Iを添加する。

液体サンプルの場合(唾、精液)

  1. サンプルを収集後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
  2. 2X T and C Lysis Solution 150 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  3. 液体サンプル150μlをチューブに移し、2で作製した(2X T and C Lysis Solution+Proteinase K)と混合する。
  4. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  5. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。

細胞サンプルの場合(哺乳類培養細胞、口腔細胞、E.coli)

  1. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  2. 遠心によって細胞(哺乳類の培養細胞では0.5~1 x 10E6、E.coliの場合0.1-0.5mlを一晩培養)をペレット状にする。約25μl溶液を残し、上清を取り除く。
  3. 10秒間ボルテックスを行い細胞をほぐす。
  4. 1で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  6. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。

組織サンプルの場合(植物や動物組織)

  1. 組織サンプル1-5 mgを回収後、直ぐに使用するか–70°Cで凍結保存する。
  2. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを1 μl加える。
  3. 新鮮な組織をホモジェナイズもしくは凍結組織を磨り潰し、チューブへ移す。
  4. 2で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、15分インキュベート; 5分ごとにボルテックス。
  6. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。

全血の場合(赤血球溶解)

  1. 採血(EDTA Vacutainer® tube等で)。200 μlをチューブに移す。
  2. Red Cell Lysis Solutionを600 μl加えて、3回反転させ混合し、チューブをタッピング
  3. 室温で5分間インキュベートし、軽くボルテックス。続けて室温に5分置いて、再度軽くボルテックス。
  4. 遠心25秒間行い、白血球をペレット化させる。
  5. 約25μl溶液を残し、上清を取り除く。ボルテックスにより細胞をほぐす。
  6. Tissue and Cell Lysis Solution 300μlを白血球に加えて数回ピペッティング。
  7. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。

ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合

  1. クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
  2. 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
  3. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
  4. 3で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  5. 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
  6. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。

ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル(FFPE)の場合  
注意:(キシレンやヘモディーを使用の場合)

  1. クリーンなmicrotome bladeを用いて、組織を取り出す。可能な限りパラフィンを除く。
  2. 10-35μmの厚さのパラフィン切片10-50mgをチューブに移す。組織をより多く使用する時は、それに応じて試薬を調整。
  3. 1-5mlのキシレンまたはヘモディーをパラフィン除去のために加えて、室温で10分インキュベート。溶媒を流す。
  4. 3のステップを繰り返す。
  5. 1-5mlの100%エタノールを加えて、室温で10分インキュベート。エタノールを流す。
  6. 5のステップを繰り返す。
  7. 残りのエタノールをすべてアスピレート。
  8. Tissue and Cell Lysis Solution 300 μlに、Proteinase Kを2 μl加えて混ぜる。
  9. 8で作製した(Tissue and Cell Lysis Solution+Proteinase K)をサンプルと混合する。
  10. 65°C、30分インキュベート; 10秒ほど軽くボルテックス。
  11. 氷上に3〜5分置いて、下記Total Nucleic Acidsの回収(核酸沈殿プロトコール))へ。

Total Nucleic Acidsの回収&Total Nucleic AcidsからDNAの除去

  1. 上記サンプル300 μl にMPC Protein Precipitation Reagentを150 μl 加えてボルテックス10秒。
  2. 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行う。もしペレットが少量やロスしていた場合、MPC Protein Precipitation Reagentを25μl混ぜて、再度ペレット化する。
  3. 上清を新しいチューブへ移す。
  4. イソプロパノール500 μlを回収した上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
  5. 4°Cで10分間遠心し核酸をペレット化させる。
  6. イソプロパノールを除去してください。ペレットが失くならないように注意して下さい。
  7. 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
  8. TE Bufferを35 μl加えて溶解して下さい。

※以下、DNA除去プロトコール

  1. ピペットでイソプロパノールを完全に除去する。Remove all of the residual isopropanol with a pipet.
  2. 1X DNase Buffer200μlにRNase-Free DNase Iを 5 μl 加えて、DNase I solutionを準備する。
  3. DNase I solution 200 μlを加えて total nucleic acidのペレットを完全に溶解する。
  4. 37°C、10分インキュベート(DNAを完全に取り除くために最大で30分のインキュベート)。
  5. 2X T and C Lysis Solutionを200 μl 加えて、5秒間ボルテックス。
  6. MPC Protein Precipitation Reagentを200μl加えて、10秒間ボルテックス。3-5分間氷上へ。
  7. 4℃で10,000 g 以上×10分間遠心を行い、ペレット化させる。
  8. RNAを含む上清を新しいチューブへ移す。
  9. イソプロパノール500μlを加えて、上清加えて、30~40回反転させながら混合して下さい。
  10. 4°Cで10分間遠心しRNAをペレット化させる。
  11. イソプロパノールを除去してください。ペRNAのペレットが失くならないように注意して下さい。
  12. 70%エタノールで2回洗い、ペレットを除去しないようにして下さい。
  13. TE Bufferを10-35 μl加えて溶解して下さい。
  14. (オプション) RiboGuard™ RNase Inhibitor を1 μl 加えて下さい。

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