アプリケーションノート

Exonuclease（エキソヌクレアーゼ）

Exonucleaseシリーズの紹介です。

Exonuclease（エキソヌクレアーゼ）とは、核酸配列を削りとる酵素です。5’末端または、3’末端から順に分解していきます。

そもそもエキソヌクレアーゼは生体内でどのような働きをしているのでしょうか？生体内では、間違ったヌクレオチドが合成された時に働くことが知られています。

以下の図のように、Ａに対して誤ってＣが組み込まれた場合、エキソヌクレアーゼは働きます。

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エキソヌクレアーゼは様々な特性を持っています。例えば、1本鎖DNAのみを分解するもの、2本鎖を分解するもの、3’末端から分解するもの等々様々な特性を持っています。これを使い分けることで、非常に役立つツールとなります。

Epicentre社で取り扱うエキソヌクレアーゼは、

があります。

それぞれの特性を表にまとめます。

酵素	活性	アプリケーション
Exonuclease I, E.coli	Mg2+存在下でssDNAを切断する3’→5’エキソヌクレアーゼ活性	・ssDNAとオリゴヌクレオチドの除去
Exonuclease III, E.coli	3’末端のニック、平滑末端、3’ 凹末端から2本鎖DNAをせん断する3’→5’ エキソヌクレアーゼ活性。チオヌクレオチドには活性がありません。RNase H, 3’-DNAフォスファターゼと脱プリン塩基DNAエンドヌクレアーゼ活性があります。	・S1ﾇｸﾚｱｰｻﾞを使用してのnested deletion ・ｼｰｹﾝｼﾝｸﾞのためのssDNAﾃﾝﾌﾟﾚｰﾄ調製・部位特異的変異導入・鎖特異的ﾗﾍﾞﾙ化ﾌﾟﾛｰﾌﾞの調製
Exonuclease VII	ssDNAを5’→3’と3’→5’の両方向にせん断	・プライマーと1本鎖オリゴの除去
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase	直鎖DNAを選択的にせん断。ニック、閉環状DNAには活性はありません。	プラスミド、BAC、fosmidから染色体DNAの除去
Rec J Exonuclease	Mg2+存在下でssDNAを切断する5’→3’エキソヌクレアーゼ活性	・dsDNAからプライマー及びssDNAの除去

それぞれの実験に合ったエキソヌクレアーゼを選ぶことが可能となっております。

Exonucleaseシリーズの中でも、Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseは、非常に好評のある製品です。

Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseは、環状ＤＮＡには作用せずに、直鎖状の1本鎖、2本鎖DNAを分解します。プラスミド、コスミド、フォスミド、BACクローンやベクター調整物にコンタミしている染色体DNAを選択的に除去します。nicked、closed環状dsDNA、スーパーコイル状のDNAは分解しません。

Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseを使用することによって、コンタミしている染色体DNAがクローニングやシーケンシングされる可能性を最小限に抑えます。

この酵素活性には中性pH、10mM Mg₂₊と1mM ATPが必要です。 Plasmid-Safe ATP-Dependent DNaseは、dsDNA、ssDNAをデオキシヌクレオチドに分解します。

下記図は、一本鎖DNAの除去にPlasmid-safeを使用した結果です。

SmaI制限酵素処理した細菌DNAとプラスミドDNAをPlasmid-Safeで処理しました。

レーン1：マーカー(1k base)
レーン2： 3μg細菌DNA (SmaI制限酵素処理)
レーン3： 500ngプラスミドDNA
レーン4： 3μg細菌DNA＋500ngプラスミド
レーン5： 3μg細菌DNA＋500ngプラスミド＋Plasmid-Safe処理

プロトコール

標準的な方法でプラスミドDNAをバクテリアから抽出します。
ペレットDNAを1x Pｌasmid-Safeバッファーに懸濁させ、ATPを最終濃度1mMになるよう加えます。
Plasmid-Safe DNaseを反応液に加えます。
1-5ml 培養液では 10 Unit
500ml 培養液では 100 Unit
37℃で次の時間インキュベートします。
1-5ml 培養液では 15分間
500ml 培養液では 2時間
75℃、30分間のインキュベーションによりPlasmid-Safe DNaseを失活させます。